Размеры строительных лесов: Строительные леса размеры

Характеристика/тип

Рамные

Штыревые

Хомутовые

Клиновые

Максимальная выс.

До 60

До 60

До 60

До 80

Сфера использования

Отделка фасадов

Отделка фасадов, кирпичная и каменная кладка

Отделка фасадов, кирпичная и каменная кладка, возведение объектов сложной формы

Отделка фасадов, кирпичная и каменная кладка

Диаметр и толщина стенок, мм

42х1,5 (высота до 30 м)

—–

48х3 (высота более 30 м)

48х3 (ЛШ-50)

—–

57 х 3,5 (Э-507)

57 х 3

48 х 3

Применение на объектах сложной формы

нет

нет

да

нет

Возможность использования на фасадах со сложной геометрией поверхности

нет

да

да

да

Максимальная длина секции, м

3,3

4,2

5

3

Размер одной секции (Д х Ш х В), м

3х1х2

3х1,6х2

3х3х2

3х1х2

2 9018 WXG13KG

Abstract

Формирование и стабильность синапсов – ключевые вопросы нейробиологии.Классически постсинаптические домены считались результатом локальной вставки и оборота белков в синапсе. Однако вставка, вероятно, будет происходить вне постсинаптических доменов, и достижения в области визуализации одиночных молекул показали, что белки диффундируют в плоскости мембраны до их накопления в синапсах. Мы количественно исследовали этот сценарий с помощью компьютерного моделирования и математического анализа, взяв для определенности конкретный случай тормозных компонентов синапсов, т.е.е. рецептор глицина (GlyR) и связанный с ним каркасный белок гефирин. Наблюдаемые размеры доменов кластеров каркаса можно объяснить динамическим балансом между агрегацией белков гефирина, диффундирующих, пока они связаны с GlyR, и их оборотом на мембране нейрона. Мы также предсказываем существование внесинаптических кластеров с характерным распределением размеров, которые вносят значительный вклад в колебания размеров синаптических доменов. Новые данные сверхвысокого разрешения для белков гефирина установили существование внесинаптических кластеров, размеры которых согласуются с предсказаниями модели в ряде параметров модели.На общем уровне наши результаты подчеркивают агрегацию с удалением как неравновесное фазовое разделение, которое приводит к образованию структур регулируемого размера.

Информация об авторе

Синапсы обеспечивают передачу информации между нейронами и являются физической опорой памяти. Было установлено, что синапсы – это динамические биологические структуры. Рецепторы нейротрансмиттеров диффундируют в мембрану нейрона, а белки синаптического каркаса постоянно обновляются. Мы предлагаем биофизическую модель, которая связывает эти различные измеряемые величины для компонентов тормозных синапсов и показывает, как они определяют размер постсинаптических доменов.Модель предсказывает, что синаптические каркасы также существуют вне синапсов и что они вносят вклад в колебания синаптических размеров. Мы подтверждаем с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения существование внесинаптических каркасов. Их распределение по размерам согласуется с предсказаниями модели для конкретных параметров. Модель должна быть полезной для лучшего понимания динамики синапсов и их возможных уровней регуляции.

Образец цитирования: Ранфт Дж., Алмейда Л.Г., Родригес П.С., Триллер А., Хаким В. (2017) Модель удаления агрегации для формирования и определения размеров постсинаптических каркасных доменов.PLoS Comput Biol 13 (4): e1005516. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516

Редактор: Франческо П. Батталья, Radboud Universiteit Nijmegen, НИДЕРЛАНДЫ

Поступила: 07.12.2016; Принята к печати: 11 апреля 2017 г .; Опубликовано: 24 апреля 2017 г.

Авторские права: © 2017 Ranft et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: JR было поддержано исследовательской стипендией Deutsche Forschungsgemeinschaft (RA 2571 / 1-1; http://www.dfg.de). PCR был поддержан Международной стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества (https://ec.europa.eu/research/fp7/). LGA была поддержана проектом Human Brain Project. Экспериментальная работа была поддержана Национальным агентством исследований (Syntaptune), грантом ERC на продвинутые исследования (PlasltInhib) и программой «Investissements d’Avenir» (ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Синапсы опосредуют передачу информации между нейронами и обычно считаются, по крайней мере частично, поддержкой памяти. Однако при исследовании на молекулярном уровне синапсы выглядят как динамические сборки, компоненты которых обмениваются на временные шкалы от десятков минут до секунд [1].Это поднимает фундаментальные вопросы о способах поддержания памяти [2]. На постсинаптической стороне рецепторы нейротрансмиттеров в основном вставлены в плазматическую мембрану нейрона в несинаптических локусах [3–5]. Одночастичные методы визуализации и отслеживания показали, что они впоследствии диффундируют в плазматической мембране в синаптические домены и из них (см. [1] для обзора и ссылок в нем). Постсинаптическая плотность (PSD) содержит каркасные белки, которые обеспечивают сайты связывания для рецепторов и временно стабилизируют их в PSD.Сила синапса определяется количеством рецепторов в PSD в данный момент. Это количество зависит от количества сайтов связывания рецепторов, обеспечиваемых каркасными белками [6], а также от сродства между рецепторами и каркасными белками [7]. Следовательно, размер PSD, то есть количество сайтов связывания каркасного белка, является ключевым фактором, определяющим синаптическую силу.

Мы сосредоточили наше исследование на тормозных синапсах, большинство компонентов которых было идентифицировано и функционально охарактеризовано.Каркасный белок гефирин является центральным структурным компонентом тормозных синапсов [8]. В большинстве случаев каркасные белки, включая гефирин [9, 10], обновляются в синаптическом домене за время от минут до часов (см. Обзор [11]). Основная олигомерная форма полноразмерного гефирина – это форма тримера, опосредованная сильными взаимодействиями N-концевых G-доменов [12–14]. В эукариотических клетках тримеры гефирина в конечном итоге подвергаются дальнейшей олигомеризации [15], которая, как предполагается, лежит в основе постсинаптического кластеризации в нейронах.Гефирин присутствует в клеточной цитоплазме, но он также может диффундировать чуть ниже плазматической мембраны, когда связывается с рецепторами [16].

В PSD, гефириновые белки образуют гомо-мультимерные каркасы непосредственно под плазматической мембраной. В последние годы были собраны точные данные о нескольких биофизических параметрах, управляющих динамикой рецепторов и каркасных белков, как описано в [1]. Были определены константы диффузии и концентрации GlyR внутри и снаружи тормозных синапсов (см. [17] и ссылки в нем).Распределение размеров PSD и гефириновых каркасов также было измерено [6].

Модель синапса, основанная на этих данных и связывающая их, необходима для решения вопросов формирования, поддержания и динамики синапсов с точной биофизической точки зрения. Совместная экспрессия в фибробластах GlyR и гефирина достаточна для генерации на плазматической мембране кластеров размеров, аналогичных размеру PSD в тормозных синапсах [9]. Это открытие послужило мотивацией для теоретического исследования того, как диффузия рецепторов, ассоциация рецепторов с каркасами и самоагрегация каркасных белков могут приводить к образованию доменов заданного размера.Некоторые предыдущие работы начали решать этот вопрос. Были предложены уравнения реакции-диффузии для описанных выше процессов, и авторы предположили, что нестабильность типа Тьюринга может лежать в основе образования синаптических доменов [18, 19]. В другом исследовании были описаны только рецепторы, и в качестве альтернативы было предложено, что кластеры синаптических рецепторов могут быть результатом динамического баланса между входящим потоком диффундирующих рецепторов и оттоком из кластера в цитоплазму клетки, опосредованного удалением рецептора [20].То, что диффузия, агрегация и удаление молекулярных компонентов могут служить для образования макромолекулярных доменов в мембране, было ранее предложено для образования и поддержания липидных рафтов и точно исследовано в этом контексте [21, 22]. Сходные механизмы, как было показано, контролируют организацию или кластеры E-cadherin на клеточных мембранах [23]. Ясно, что время жизни кластера белков может быть на много порядков больше, чем время жизни его составляющих, что является привлекательной особенностью для структуры хранения в памяти [2], которая ранее была теоретически исследована [24].

Основываясь на этих предыдущих работах, мы теперь исследовали характеристики каркасных доменов, продуцируемых каркасными белками (здесь гефирином), связанными с рецепторами (здесь GlyR), диффундирующими в плазматическую мембрану. Принимая во внимание доступные биофизические данные [6, 9, 16], мы сначала делаем вывод, что комбинированный эффект агрегации, диффузии и удаления производит типичные размеры доменов каркаса, которые аналогичны наблюдаемым экспериментально. Затем компьютерное моделирование на основе частиц и теоретический анализ позволяют нам всесторонне охарактеризовать размеры и динамику кластеров в результате этих основных процессов.В согласии с предыдущими работами по агрегации и удалению в других контекстах [25, 26], мы показываем, что агрегация и удаление каркасных белков обеспечивает неравновесный процесс, лежащий в основе распределения динамически развивающихся каркасных доменов разного размера. Кроме того, мы предсказываем, как распределение размеров этих доменов зависит от биофизических параметров, таких как время оборота каркасных белков на плазматической мембране и зависимость диффузии кластеров от размера.

Фактическое распределение кластеров гефирина по размерам было измерено в культивируемых нейронах спинного мозга с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения.Сравнивая эти новые наблюдения с модельными прогнозами, мы затем делаем вывод о биофизических параметрах, которые управляют сборкой гефириновых доменов в соответствии с предложенной моделью агрегации, диффузии и обмена белков.

Результаты

Баланс между латеральной агрегацией и цитоплазматической рециркуляцией белков каркаса устанавливает размер домена каркаса

Мы решили оценить совместную роль

1. латеральная диффузия связанных комплексов каркас-рецептор в мембране,
2. скаффолдинг белковой агрегации и
3. Удаление белка каркаса на мембране и в каркасах

, сначала проанализировав сокращенную модель динамики белка каркаса на мембране, см. Рис. 1.В этой модели единственный каркасный домен окружен диффундирующими “частицами” каркаса (т. Е. Тримерами гефирина), связанными с рецепторами. Край домена действует как поглощающая граница на диффундирующих комплексах, тем самым создавая градиент концентрации, который, в свою очередь, вызывает входящий диффузионный поток белков каркаса.

Рис. 1. Боковая диффузия и агрегация комплексов каркас-рецептор на постсинаптической мембране.

A: Схема основных процессов модели: рецепторы (GlyR, синий) и «частицы» каркаса (тримеры гефирина, зеленый) могут образовывать комплексы; частицы каркаса доставляются к клеточной мембране с потоком J и покидают ее со скоростью k ; субмембранные частицы каркаса агрегируют посредством гомотипических взаимодействий с белками каркаса; Комплексы каркас-рецептор диффундируют латерально вдоль клеточной мембраны с константой диффузии D .B: Профиль концентрации диффундирующих частиц каркаса вокруг дискообразной области каркаса радиусом R . Вдали от кластера концентрация диффундирующих частиц каркаса однородна и равна Дж / k . Распространяющиеся частицы каркаса обеднены слоем размером, близким к границе кластера. C: Зависимость размера стационарного домена N от концентрации частиц c ₀ . D: Зависимость N от скорости оборота k .Контрольные параметры приняты равными D = 0,02 мкм м ² / с [16], k = 1 / (30 мин) [9], c ₀ = 4/3 мкм м ⁻² [16, 27]. Концентрация каркасных частиц / тримеров в постсинаптическом домене принята равной ? = 5000/3 мкм м ^-2 [6]. Когда параметры изменяются в B и C, контрольные значения отмечаются (красный лозунг).

https://doi.org/10.1371 / journal.pcbi.1005516.g001

Поскольку этот приток растет максимально по периметру домена, в то время как отток белка из-за десорбции агрегированных белков каркаса в цитоплазму масштабируется с площадью домена, баланс обоих потоки возникают для четко определенного размера домена. Результирующий равновесный размер может быть рассчитан аналитически (см. S1 Text: Single scaffold domain) и зависит от биофизических параметров, таких как коэффициент диффузии комплексов каркас-рецептор во внесинаптической мембране D ₀ , скорость удаления белков каркаса k , общая поверхностная концентрация белков каркаса на мембране c ₀ и плотность белков каркаса внутри домена ρ .Обратите внимание, что k – это эффективная скорость, которая улавливает любой локальный дисбаланс связывания и отсоединения каркасных частиц от и внутрь цитоплазмы, соответственно. Измеренное в количестве N частиц каркаса, его «строительных блоков», выражение для размера домена выглядит следующим образом: (1) (Явная форма функции Φ ( x ) дается уравнением (S5, S7) в S1 Text: Single scaffold domain.) На рис. 1C и 1D размер домена N показан как функция от c ₀ и k соответственно.

Чтобы проверить правдоподобность образования и обслуживания каркаса путем диффузии и удаления, мы рассчитываем ожидаемый размер домена, используя приведенное выше уравнение и оценки параметров для гефирина и GlyR из литературы, см. Рис. 1. Предполагая, что наименьшая встречающаяся единица гефирина или «строение block »представляют собой тримеры гефирина [12–14], мы получаем приблизительный размер домена N 70 тримеров или 210 мономеров гефирина, что удивительно близко к ранее опубликованным измерениям размеров доменов гефирина [6].Таким образом, мы заключаем, что диффузия, агрегация и оборот действительно могут быть ключевыми механизмами, участвующими в установлении размера синаптических каркасных доменов.

Приведенный выше анализ явно связывает размер постсинаптических гефириновых доменов с измеренной константой диффузии GlyRs и скоростью оборота гефирина в каркасных доменах. Однако он основан на простом предположении об одном кольцевом домене гефирина, окруженном диффундирующими комплексами тримера GlyR-гефирина. Для дальнейшего изучения предложенного сценария формирования постсинаптического каркасного домена мы приступаем к изучению более подробной, действительно основанной на частицах модели агрегации каркаса с помощью компьютерного моделирования.Это позволяет нам проверить влияние упрощающих предположений, таких как предполагаемая округлость доменов каркаса, и рассмотреть возможность множественных диффузионных доменов каркаса различных размеров. Самое интересное, что это позволяет нам получать прогнозы от модели о распределении размеров каркасных доменов, которые мы затем сравниваем с новыми данными.

Модель динамики каркасного белка на мембране на основе частиц

В моделировании на основе частиц мы рассматриваем отдельные частицы каркаса, прикрепленные к мембране, которые диффундируют латерально на мембране.Частицы связываются друг с другом при встрече во время их случайных диффузионных траекторий, имитируя гомотипические взаимодействия белков каркаса.

Поскольку детали агрегации каркаса, диффузии и динамики предметной области еще предстоит описать, мы решили сделать простые предположения, чтобы получить вычислительно эффективную модель с несколькими параметрами, как подробно описано ниже (см. Также Материалы и методы для деталей нашей реализации). .

Частицы собираются при встрече и образуют кластеры.Мы предполагаем, что частицы в кластере перестраиваются в круговую дискообразную форму домена. (Чтобы проверить влияние этого предположения, мы также выполнили несколько симуляций, где, напротив, не допускались никакие перегруппировки, как описано ниже.)

Дискообразные скопления могут сами диффундировать и агрегироваться. Таким образом, нам необходимо предписать возможную зависимость постоянной диффузии от размера. Теория Саффмана-Дельбрюка [28] для термодиффузии предсказывала бы логарифмическую зависимость константы диффузии от размера, возникающую из-за гидродинамических эффектов (см., Однако, [29] для белков, размер которых сравним с толщиной мембраны).Этот классический результат может быть изменен возможными взаимодействиями каркасных белков с корой клеток, нетепловыми эффектами, а также более сложной природой опосредованной рецепторами диффузии каркасных доменов. Для простоты и во избежание введения характерного размера «ad hoc» мы рассматриваем степенную зависимость размера (2) где D ( n ) – константа диффузии кластеров, содержащих n каркасных частиц, а σ – показатель степени зависимости от размера ( σ = 0, когда применяется результат Саффмана-Дельбрюка [28]).В нашей модели σ является дополнительным параметром системы в дополнение к тем, которые были введены ранее.

Предполагается, что частицы десорбируются в цитоплазму с эффективной скоростью k , моделируемой стохастическим удалением отдельных частиц с мембраны. Мы предполагаем постоянную скорость k , независимо от размера области, к которой принадлежат частицы. Как показано ниже, этого предположения достаточно, чтобы учесть имеющиеся данные. Мы также пренебрегли латеральной десорбцией частиц в мембране после агрегации, поскольку сродство связывания между тримерами гефирина высокое.Это равносильно предположению, что концентрация диффундирующих частиц гефирина в мембране велика по сравнению с концентрацией в равновесии с конденсированной фазой каркаса (т.е. мы пренебрегаем «давлением паров» гефирина). Существование значительной латеральной десорбции фактически привело бы к уменьшению входящего потока частиц на каждый кластер и к занижению нашей нынешней подобранной константы диффузии. Боковая десорбция также будет способствовать более компактным агрегатам [30] (см. Также Обсуждение) в случае динамики частичной перегруппировки.

Десорбция частиц уравновешивается поступающим потоком Дж отдельных частиц на мембрану, что гарантирует, что средняя общая концентрация частиц, прикрепленных к мембране c ₀ = Дж / k , остается постоянной. .

Внесинаптическая агрегация синаптических белков

Типичный снимок нашего моделирования показан на рис. 2A. Выйдя за рамки упрощенного предположения об одном недиффузирующем домене каркаса, мы, в частности, обнаруживаем в наших симуляциях непрерывное образование небольших кластеров на мембране.Эти кластеры продолжают диффундировать, хотя и медленнее из-за их увеличенного размера, что приводит к ансамблю кластеров всех размеров (рис. 2A – 2C). В конце концов, рост конкретного кластера ограничен оборотом составляющих его каркасных частиц, аналогично приведенной модели единственного домена, обсужденной выше.

Рис. 2. Моделирование образования каркасных доменов.

Если не указано иное, значения параметров моделирования равны k = 2,0 ⋅ 10 ⁻⁵ D ₀ ρ , c ₀ = 0.9 10 ⁻³ ρ , где ρ = 0,77 a ⁻² и a – диаметр основных частиц, а показатель диффузии (уравнение (2)) равен σ = 0,5. A: Снимок динамики домена каркаса. Шкала шкалы 100 a ; отдельные кластеры увеличены в 3 раза для лучшей визуализации. B: Характерное распределение наблюдаемых размеров кластера не зависит от деталей внутренней структуры кластера. Распределение кластеров по размерам показано для моделирования на панели A (черные кружки) с идеальной перестройкой частиц, т.е.е. дискообразные кластеры и для моделирования без перегруппировки частиц, но с идентичными параметрами (красные точки; снимок моделирования и типичный кластер показаны на вставке). Обратите внимание, что плотность фрактальных кластеров непостоянна и зависит от размера кластера; для сравнения используется плотность ρ = 0,77 a ⁻² дискообразных кластеров. Вставка масштабной линейки 50 a . C: Характерные распределения размеров кластеров при моделировании с разными показателями диффузии σ , но в остальном идентичными параметрами (закрашенные кружки).Данные для σ = 0,5 соответствуют моделированию, показанному на A. На результаты моделирования накладываются теоретические кривые, полученные из уравнений скорости (сплошные линии), подробности см. В тексте. D: Масштабирование типичного размера кластера 〈〈 n 〉〉 с c ₀ D ₀ / k для различных σ и c ₀ . Сплошная черная линия: 〈〈 n 〉〉 ∝ c ₀ D ₀ / k ; пунктирная черная линия: 〈〈 n 〉〉 ∝ ( c ₀ D ₀ / k ) ^1/2 .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g002

В качестве довольно общего результата мы обнаруживаем, что кластеры становятся все реже с увеличением размера (рис. 2B и 2C). Распределение кластеров по размерам для показателя постоянной диффузии σ = 0,5 показано на фиг. 2B как при полной перегруппировке агрегирующих частиц в кольцевые домены, так и, наоборот, когда перегруппировка не выполняется после агрегации. В то время как перегруппировка после кластеризации имеет большое влияние на форму домена (см. Вставку на рис. 2B), ее влияние на распределение размера кластера незначительно.Это справедливо и для других показателей постоянной диффузии. Поскольку здесь мы не сосредотачиваемся на формах каркасных доменов, для вычислительной эффективности мы рассматриваем далее только полностью перестроенные кластеры.

Форма распределения кластеров по размерам определяется размерной зависимостью константы диффузии кластеров (рис. 2C). Качественно, когда σ увеличивается от нуля (т.е. диффузия больших кластеров все больше подавляется), предел больших размеров распределения уменьшается, что подразумевает меньший диапазон размеров кластеров.Кластеры также более равномерно распределены по доступному диапазону размеров.

Распределения кластеров по размерам, полученные при моделировании частиц, количественно сравниваются на рис. 2C с численными решениями скоростных уравнений Смолуховского [25, 26, 31, 32] (см. S1 Text: Rate Equations). Эти уравнения довольно точно учитывают полученные распределения после подбора одного общего кинетического параметра (см. S1 Text: Rate Equations и S1 Fig). Для постоянной диффузии, не зависящей от размера, можно аналитически показать, что распределение является степенным с показателем -3/2 и экспоненциальным отсечением (уравнение.S14 в S1 Text: Rate Equations). В общем случае σ ≠ 0, скоростные уравнения по-прежнему позволяют нам численно определить стационарное решение для распределения кластеров по размерам (см. Также S1 Рис.). Когда σ > 0, диффузия постепенно замедляется для все больших и больших кластеров. Эта уменьшенная диффузия ограничивает рост больших кластеров по сравнению с меньшими кластерами, и распределение смещается в сторону меньших размеров с увеличением σ . Форма постепенно отклоняется от степенного закона, наблюдаемого для σ = 0, что в конечном итоге приводит к появлению плеча при меньшем размере отсечки, за пределами которого кластеры снова становятся экспоненциально редкими.

Кластеры большего размера встречаются реже, чем кластеры меньшего размера, но поскольку они содержат больше частиц каркаса, большинство частиц каркаса все же можно найти в кластерах большого размера. Полезной величиной для характеристики таких распределений является «типичный» размер кластера, который соответствует среднему размеру кластера, когда кластеры взвешиваются по количеству содержащихся в них частиц. Он определяется как 〈〈 n 〉〉 ≡ ∑ _n n ² c _n / ∑ _n nc _n , где c _n – концентрация кластеров размером n .

Типичный размер кластера как функция биофизических параметров диффузии и оборота показан на рис. 2D. Мы обнаружили, что для заданного показателя зависимости постоянной диффузии от размера σ , типичный размер существенно зависит от безразмерной комбинации параметров c ₀ D ₀ / k в соответствии с (3) Для постоянной поверхностной концентрации частиц каркаса c ₀ и заданного σ типичный размер кластера увеличивается с общей постоянной диффузии D ₀ и уменьшается с более высокой эффективной скоростью оборота k .(Обратите внимание, что при постоянном потоке цитоплазматических частиц Дж на мембрану изменение k также изменяет общую поверхностную концентрацию через c ₀ = Дж / k .) В противоположном случае при изменении c ₀ при сохранении продукта c ₀ D ₀ / k постоянным, типичный размер кластера остается примерно постоянным; соответственно, масштабирование 〈〈 n 〉〉 с помощью c ₀ D ₀ / k не зависит от конкретного значения c ₀ , для которого было выполнено моделирование.

В принципе, масштабный показатель α зависит от точной формы распределения кластеров по размерам, но простой масштабный аргумент рационализирует наблюдаемое соотношение (уравнение 3). Предполагая, что большинство частиц каркаса агрегировано в кластеры размером N , концентрация этих кластеров определяется как c _N ≃ c ₀ / N . Таким образом, среднее расстояние между кластерами масштабируется как.Константа диффузии кластеров определяется как D _N = D ₀ N ^{– σ} , временная шкала их диффузионного столкновения масштабируется как T ∝ L ² / D _N ≃ N ^{1+ σ} / ( c ₀ D ₀ ). Чтобы N был стабильным размером кластера, эта шкала времени должна соответствовать типичному времени оборота 1/ k , иначе кластеры либо тают, либо вырастут в размерах.Тогда сразу получается N ∝ ( c ₀ D ₀ / k ) ^{1 / (1+ σ )} .

Распределение кластеров гефирина по размерам

Наше моделирование предсказывает, что размеры каркасных доменов зависят от непрерывной агрегации каркасных белков в кластеры на мембране, которые, в свою очередь, обеспечивают образование более крупных доменов. Поскольку ожидаемое распределение размеров кластеров определяется биофизическими параметрами диффузии и оборота, эти параметры в принципе могут быть выведены из наблюдаемых распределений размеров кластеров каркаса.Таким образом, мы экспериментально определили распределение размеров гефириновых каркасов в нейрональной мембране культивируемых нейронов спинного мозга, как для подтверждения предыдущих выводов о существовании внесинаптических кластеров, так и для измерения соответствующих параметров D ₀ / k , c ₀ и σ . С этой целью микроскопия сверхвысокого разрешения на фиксированных нейронах использовалась для подсчета количества отдельных белков гефирина в кластерах (см. Ранее опубликованные материалы и методы [6]).Вкратце, флуоресцентно меченные белки гефирина стохастически активируются при низкой интенсивности света, так что вероятность одновременной активации близлежащих белков исчезающе мала. Таким образом, пространственно разделенные световые всплески активированных белков могут быть локализованы с точностью до субволновой длины. Поскольку каждый меченый белок активируется один раз перед тем, как попасть в «темное» состояние, вся популяция белка может быть отображена в ходе эксперимента, а кластеры реконструированы по зарегистрированным положениям частиц, см. Рис. 3A – 3C.

Рис. 3. Кластеры гефирина и сравнение с модельными распределениями.

A: Обычная флуоресцентная микроскопия нейронов спинного мозга, экспрессирующих белок mEos2-гефирин. Масштаб 5 μ м. B: визуализированное PALM-изображение со сверхвысоким разрешением того же сегмента, показанного на A, получено более 20 тыс. Кадров с частотой кадров 20 мс. C: Пуантилистическое представление точки B, где каждая точка представляет собой одно обнаружение. D: Максимальное правдоподобие экспериментально определенных распределений для данных параметров k и σ , с оптимальным c ₀ , варьирующимся индивидуально для каждой культуры (материалы и методы).Выделенная область параметров (оранжевый) соответствует 95% вероятности для N = 10000 повторных подгонок случайных выборок начальной загрузки из экспериментальных распределений. Серая заштрихованная область соответствует экспериментально вероятному диапазону k / D ₀ = 1,4 · 10 ⁻² – 4,2 · 10 ⁻¹ μ м ⁻² . E: Экспериментально определенное распределение размеров кластеров гефирина и подобранные распределения для всех трех культур.Экспериментальные концентрации были безразмерны с использованием тримера ρ = 5000/3 μ м ⁻² .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g003

Количество обнаружений напрямую связано с размером кластера гефирина [6]. Мы находим кластеры гефирина всех размеров, вплоть до кластеров из 71 тримеров (см. Рис. 3E, рис. S2). Самые большие домены, вероятно, будут постсинаптическими, 89% из которых обнаружены прикрепленными к синаптическим терминалам в предыдущей работе [33].Меньшие кластеры гефирина должны соответствовать внесинаптическим кластерам, что согласуется с так называемыми нанокластерами, ранее визуализированными вне синапсов с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения [6].

Существование кластеров разного размера соответствовало нашим предсказаниям. Поэтому мы сравнили экспериментально измеренные распределения с распределениями, созданными нашей моделью для различных комбинаций параметров. Вычисляя вероятность данных для заданных теоретических распределений, мы определили параметры, которые лучше всего объясняют наши данные и которые мы называем максимально вероятным соответствием нашей модели.Комбинируя этот анализ для всех культур ( n = 3), позволяя общей концентрации каркаса, c ₀ , варьироваться между культурами, мы получаем глобальную оценку показателя диффузии, σ = 0,5, и отношения постоянной диффузии по скорости оборота частиц, D ₀ / k = 30 мкм м ² , см. рис. 3D. Общая концентрация каркаса варьируется в зависимости от культур от c ₀ = 0.5-5 мкм м ^-2 , см. Рис. 3E.

Кластерная динамика и флуктуации размеров каркасных доменов

Наше моделирование позволяет нам учитывать временные колебания размеров кластеров каркаса и их стабильность во времени. Траектория размера отдельного кластера показана на рис. 4А. Он колеблется около четко определенного среднего размера, чередуясь между стохастическим увеличением из-за слияния с другими кластерами и относительно плавным уменьшением в характерном временном масштабе τ _fluc из-за непрерывной потери частиц в цитоплазму.Такое поведение типично для всех отслеживаемых кластеров. В частности, кластеры с небольшими начальными размерами растут путем слияния с другими кластерами и колеблются около среднего размера после нескольких τ _fluc (рис. 4A, голубые линии). Это приводит к тому, что распределение размеров, исследуемое кластером во времени, показанное на рис. 4B, отличается от мгновенного распределения всех кластеров на мембране в данный момент времени (рис. 3E) с подавлением малых размеров кластера. Автокорреляция размера кластера C ₂ ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t )〉 – 〈 n 〉 ² позволяет количественную оценку динамики флуктуаций около среднего размера кластера.Он показан на рис. 4C как для моделирования на основе частиц, так и для моделируемых траекторий на основе подхода основного уравнения (см. S1 Text: Rate Equations). Упрощенное описание последнего подхода обеспечивает явное выражение для C ₂ ( τ ) и предсказывает, что τ _fluc задается скоростью оборота белка каркаса, τ _fluc ≃ 1 / k (см. S1 Text: Rate Equations) в хорошем количественном согласии с результатами моделирования.

Рис. 4. Прогнозируемое изменение размера отдельных кластеров.

A: эволюция среднего размера кластера (среднее ± стандартное отклонение) для кластеров начального размера из 2 (светло-голубых) и 100 (светло-красных) частиц соответственно, усредненных по независимым смоделированным траекториям размера кластера ( n ₂ = 50 ⋅ 10 ⁶ , n ₁₀₀ = 4000), взятых из моделирования. Также показана типичная траектория размера кластера (темная сплошная линия). Параметры моделирования идентичны рис. 2А.B: Распределение размеров кластера на долгое время. Большие кластеры сохраняются в течение длительного времени и исследуют распределение по размерам, показанное здесь, благодаря добавлению частиц путем слияния с другими кластерами и удалению частиц путем десорбции. Распределение, полученное по смоделированным траекториям ( n = 1000) с использованием подхода основного уравнения (MEQ) (серая сплошная линия, подробности см. В тексте), немного отличается, поскольку пространственные корреляции игнорируются. C: Автокорреляция, C ₂ ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t )〉 – 〈 n 〉 ² , из размер кластера n ( t ), полученный из моделирования полной частицы (черная сплошная линия) и из метода MEQ (сплошная серая линия).Также показан аналитический прогноз экспоненциального затухания с характерной скоростью k (пунктирная серая линия). D: Функция Y ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t ) ² 〉 – 〈 n ( t + τ ) ² n ( t )〉 (сплошная черная линия). Тот факт, что Y ( τ ) не равно нулю, означает, что динамика не инвариантна относительно обращения времени и, следовательно, находится вне термодинамического равновесия.Также показана аппроксимация Y ( τ ) ∝ exp (- kτ ) [1 – exp (- kτ )] (серая пунктирная линия), а также функция Y ( τ ) генерируется методом MEQ (сплошная серая линия) (подробности см. в тексте и тексте S1: уравнения скорости).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005516.g004

Изменение размера кластера во времени, показанное на рис. 4A, явно не инвариантно при обращении времени. Интересно отметить, что это прямой признак того, что рассматриваемый процесс находится вне термодинамического равновесия, поскольку флуктуации термодинамического равновесия не должны позволять определять стрелу времени.Одной количественной мерой неравновесности основной динамики служит третий момент Y ( τ ) = 〈 n ( t + τ ) n ( t ). ) ² 〉 – 〈 n ( t + τ ) ² n ( t )〉 [34, 35], которое по построению исчезает для систем, инвариантных относительно обращения времени. Нетривиальная функция Y ( τ ), полученная из временных траекторий размера кластера, показана на рис. 4D вместе с приближениями, основанными на подходе основного уравнения (см. S1 Text: Rate Equations).

Обсуждение

Мы предлагаем модель формирования и обслуживания каркасных доменов. Он основан на

1. доставка каркасных белков на плазматическую мембрану,
2. рецептор-опосредованная диффузия каркаса на плазматической мембране и
3. рост скаффолда при встрече и мультимеризация с другими скаффолдами.

Уравновешивание этого процесса роста кластеров путем непрерывного удаления каркасных белков приводит к стабилизации максимального размера домена, а также к стационарному распределению кластеров каркаса разного размера.В предыдущей работе [6] было показано, что популяция небольших внесинаптических кластеров сосуществует с большими синаптическими кластерами, но размеры первых точно не были определены количественно. Мы здесь предоставили новые данные микроскопии сверхвысокого разрешения, которые показывают, что постсинаптические кластеры принимают непрерывный диапазон размеров от тримеров гефирина до размеров, характерных для синаптических доменов. Это согласуется с характерной характеристикой динамики агрегации-удаления, которая лежит в основе их образования.Сравнение экспериментальных данных с модельными распределениями по размерам позволило уточнить биофизические параметры этой динамики. Более того, мы обнаружили, что существование диффундирующих внесинаптических кластеров имеет важные последствия для флуктуаций размера синаптических доменов, так как первые могут сливаться со вторыми. Наше моделирование было сосредоточено на динамике этих внесинаптических кластеров. Когда один из них отслеживается с течением времени, он достигает на шкале времени в час большого размера области распределения размеров домена и колеблется вокруг него, как показано на рис. 4A.В простейшем представлении синаптические домены являются просто продуктом этого процесса формирования, и их распределение по размерам показано на рис. 4В. Однако это, скорее всего, чрезмерное упрощение, поскольку свойства синаптических каркасных доменов определенно отличаются от внесинаптических. Например, мы ожидаем, что они будут распространяться даже меньше, чем большие внесинаптические каркасные домены. Это уменьшит их вероятность столкновения с другими доменами и, следовательно, их размер (моделирование с одним фиксированным доменом показывает уменьшение среднего размера на 33% по сравнению с рис. 4B).

В последние годы было обнаружено, что термодинамические фазовые переходы и фазовое разделение лежат в основе формирования различных клеточных безмембранных структур [36], в последнее время PSDs возбуждающих синапсов [37]. Одна особенность термодинамического разделения фаз состоит в том, что рост конденсированной фазы ограничивается только истощением конденсирующего компонента. Таким образом, размер образованной структуры определяется размером ее «контейнера», а также общим количеством молекулярных компонентов, заключенных в нем [38].В клетках контейнером может быть вся клетка или одно из ее подразделений, например, позвоночник для возбуждающего PSD. Неравновесное разделение фаз может позволить клеткам избежать этого ограничения и сформировать локализованные структуры определенного размера, такие как PSD, независимо от размера компартмента, в котором они формируются, а именно всей мембраны нейрона для большинства тормозных синапсов. Агрегация с удалением или оборотом была предложена в различных клеточных контекстах [21, 23] помимо рассматриваемого здесь.Заманчиво предположить, что это особый, легко реализуемый механизм разделения фаз, выходящий за рамки термодинамического равновесия, обычно используемый клетками для формирования локализованных структур.

Наши результаты расширяют предыдущие работы, рассматривая неравновесную динамику рецепторов и каркасов на плазматической мембране. Хотя Haselwandter et al. [18, 19] рассмотрели общие непрерывные уравнения взаимодействия рецепторов и белков каркаса, они проанализировали другой динамический режим. Их математический анализ показал, что домены характерного размера могут быть получены с помощью неустойчивости типа Тьюринга.В этом случае кооперативное связывание белков каркаса в синаптических доменах ограничивается рецепторами, диффундирующими от домена, и стерическим отталкиванием между рецепторами. Однако неясно, подтверждаются ли все эти предположения в нейронах, поскольку, например, плотность рецепторов оказывается намного ниже насыщения на синаптических доменах [39, 40]. Более того, в этом режиме Тьюринга нельзя ожидать непрерывного диапазона размеров доменов. Бурлаков и др. [20] предложили модель, основанную на агрегации и удалении рецепторов, сходную по духу с моделью, описанной на рис. 1, но они не рассматривали каркасные белки или распределение кластеров по размерам.

В настоящем исследовании мы изучили простую модель формирования PSD с минимальным количеством параметров, большинство из которых определяется имеющимися данными. Тем не менее, некоторые из наших предположений, возможно, потребуют уточнения, когда появятся дополнительные данные. В нашей модели рецепторы действуют в основном как переносчики, которые обеспечивают латеральную диффузию каркасных частиц и доменов вдоль клеточной мембраны. Наша единая скорость k для удаления каркаса с мембраны учитывает как диссоциацию каркаса от рецепторов, так и эндоцитоз комплексов рецептор-каркас.В настоящее время этого кажется достаточно, но рецепторы, возможно, необходимо учитывать независимо от каркасов, если кто-то хочет более точно описать эти два процесса. Описание с множеством молекулярных видов также необходимо для описания концентрации рецепторов на каркасных доменах, ее зависимости от сродства каркасных рецепторов, а также влияния рецепторов на стабильность каркасных доменов. Также может потребоваться включение зависимости удаления каркаса от размера домена каркаса.

В основном мы рассмотрели предел, при котором домены каркаса очень эффективно перестраиваются и принимают сферическую компактную форму.Мы показали, что это не имеет значительных последствий для динамики кластеров и распределения размеров, рассматривая другой крайний предел пренебрежимо малой перестройки кластера после агрегации каркаса, см. Рис. 2B. Однако форма отдельных кластеров каркаса действительно зависит от перегруппировки частиц каркаса внутри домена или от его отсутствия (см., Например, вставку на фиг. 2В). Хорошо известно, что в отсутствие рециклинга кластеры, которые растут за счет диффузии, склонны к нестабильности формы и что формы чувствительны к изменениям в динамике.Типичным примером является классическая модель агрегации, ограниченной диффузией (DLA) [41], где кластеры растут за счет необратимой агрегации очень разбавленных одиночных мономеров без перегруппировки. Такие кластеры принимают изотропные разветвленные формы с фрактальной размерностью d _f ≃ 1,7 для диффузии мономера в двух измерениях ( d = 2), как здесь рассматривается. Предпочтительные направления прикрепления или кристаллическая анизотропия делают кластеры анизотропными, как это обычно наблюдается со снежинками [42].Когда не только мономеры, но и кластеры диффундируют и агрегируют – случай, известный как агрегация кластер-кластер – образующиеся кластеры отличаются фрактальной размерностью d _f ≃ 1,45 [30]. Рост в растворе мономера конечной концентрации c ₀ делает кластеры DLA компактными выше характерной длины, которая зависит от c ₀ [30]. Кроме того, удаление мономеров вводит «диффузионную длину», выше которой кластеры также перестают быть фрактальными.С параметрами на фиг. 3D, λ ≃ 5 мкм м намного больше, чем линейный размер синаптических доменов. Следовательно, будет интересной задачей для будущих исследований, как экспериментальных, так и теоретических, изучить удаление каркасного белка из каркасного домена и способы перестройки каркасного домена и связать их с наблюдаемыми формами, которые не кажутся ни круговыми, ни полностью фрактальными.

Сила синапса – одно из его ключевых свойств, поскольку оно контролирует эффективность передачи информации между нейронами.Однако, когда синапсы отслеживаются в течение нескольких дней, они претерпевают большие колебания в размере и молекулярном содержании. Это справедливо для нейронов , культивируемых in vitro, , при отсутствии протоколов обучения и даже при отсутствии активности [43]. Было обнаружено, что феноменологическая модель, основанная на смешанном аддитивно-мультипликативном стохастическом процессе [44], хорошо объясняет зарегистрированные колебания размера возбуждающих [45], а также тормозных [46] синапсов. Интересно, что мы обнаружили здесь, что существование диффундирующих внесинаптических кластеров может обеспечить механистическое объяснение сходных флуктуаций размеров каркасных доменов в течение более коротких периодов.Прогнозируемое распределение флуктуирующих размеров доменов искажено (см. Рис. 4B) и качественно аналогично сообщенным (см., Например, рис. 4 в ссылке [46]).

Помимо спонтанных флуктуаций, выяснение механизмов, с помощью которых специфически модифицируется синаптическая сила, остается ключевой проблемой. Роль латеральной диффузии рецепторов в плазматической мембране в опосредовании изменений количества рецепторов в синапсе начали рассматривать в контексте синаптической пластичности [1, 8] и гомеостаза синаптической силы [47].Как латеральная подвижность GlyR в клеточной мембране, так и его сродство к связыванию с гефирином [48] можно регулировать. В рамках модели, которую мы предлагаем, это будет вызывать изменения не только в концентрации рецепторов на каркасных доменах, но также и в размере самих каркасных доменов, изменяя латеральный поток каркасных белков на домен. Время удаления каркасных белков является в нашей модели еще одним важным параметром, на который можно воздействовать, чтобы регулировать размер каркасного домена.В этом контексте можно отметить, что меньшие размеры гефириновых доменов наблюдались в однонедельных органотипических культурах по сравнению с четырехнедельными культурами [10], в то время как, соответственно, среднее время пребывания гефирина в каркасном домене было измерено как короче в однонедельных культурах, чем в четырехнедельных культурах [10]. Мы уверены, что модель с биофизическими корнями, такая как та, которую мы предлагаем здесь, предлагает новые взгляды на синаптическую динамику, гомеостаз и пластичность, которые будет полезно изучить в будущих работах.

Материалы и методы

Моделирование

Как описано в Результатах, мы реализовали две версии базовой модели, которые соответствуют двум пределам перегруппировки частиц внутри кластеров. В модели A частицы внутри данного кластера немедленно перестраиваются в диск с радиусом, задаваемым числом частиц n и типичной плотностью числа частиц в кластерах ρ ,. В модели B отдельные частицы не перестраиваются, а кластеры образуют фрактальные структуры.Обе модели по существу дают одинаковое распределение размеров кластеров, см. Рис. 2B. Если явно не указано иное, все представленные результаты моделирования были получены с моделью A по причинам уменьшения вычислительной сложности.

При моделировании все соответствующие величины и параметры выражаются в единицах длины l ₀ = a и времени t ₀ = a ² / D ₀ соответственно, где a – диаметр, а D ₀ – постоянная диффузии отдельной частицы.Первоначально N = c ₀ L ² частиц случайным образом распределены в пространстве в квадрате со стороной L , и мы используем периодические граничные условия повсюду. Диффузия и круговорот частиц аппроксимируются дискретными временными шагами Δ t = 0,02, малыми по сравнению с характерным временем t ₀ диффузии частиц. Во время каждого шага мы сначала обновляем позиции частиц и кластеров, проиндексированные как i = 1,…, M , случайными приращениями в соответствии с соответствующей постоянной диффузии D _i , т.е.е., приращения x и y, полученные из нормального распределения с дисперсией 2Δ tD _i и исчезающим средним. Частицы или кластеры, которые впоследствии перекрываются, сливаются, образуя кластер размером n _i + n _j , где n _i и n _j являются размеры сливающихся кластеров / частиц и соответственно обновленный радиус. В конце концов, мы извлекаем количество десорбированных частиц на кластер за один временной шаг из биномиального распределения с n _i независимых отрисовок, каждый из которых имеет вероятность Δ t k , и соответственно уменьшаем размеры и радиусы кластера.Для простоты мы оставляем общее количество частиц в моделировании постоянным и вставляем столько новых, случайно распределенных частиц, сколько было удалено.

Моделирование обычно проводилось с частицами N ≃ 10 ⁴ , при этом размер коробки L изменялся, соответственно, для различных концентраций c ₀ . В нашем моделировании мы выбрали плотность кластеров ρ = 0,77 a ⁻² , что соответствует фракции упаковки гексагонального расположения; однако сравнение с моделированием фрактальных кластеров показывает, что результаты не сильно зависят от этого выбора.

Реактивы

Если не указано иное, все реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) или Life Technologies / Molecular Probes (Карлсбад, Калифорния).

Лентивирус

Лентивирус, кодирующий mEos2-Gephyrin, был получен путем котрансфекции плазмиды лентивирусного остова (FUGW), кодирующей конструкцию mEos2-Gephyrin (5 мкМ г) вместе с оболочкой pMD2.G (5 мкл г) и упаковкой pCMVR8.74. (7,5 мкг г) плазмиды (Addgene, Кембридж, Массачусетс) в клетки HEK293T с использованием липофектамина 2000 (60 мкл мкл).Трансфекцию проводили в 10-см планшетах после того, как клетки достигли 80% слияния. Супернатант, содержащий лентивирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, мкм, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.

Культура клеток и инфекция

Все эксперименты проводили на культурах диссоциированных нейронов спинного мозга, полученных от крыс Sprague-Dawley (на E14). Эксперименты проводились в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ 2010 / 63EU от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях, и наши протоколы были одобрены комитетом Чарльза Дарвина в экспериментах на животных (Ce5 / 2012/018).Нейроны высевали с плотностью 6,3 × 10 ⁴ клеток / см ² на покровные стекла 18 мм, предварительно покрытые 70 μ г / мл поли-D, L-орнитина и 5% фетальной телячьей сывороткой. Культуры поддерживали в нейробазальной среде, содержащей B-27, 2 мМ глутамина, 5 ед / мл пенициллина и 5 мкл мкг / мл стрептомицина при 37 ° C и 5% CO ₂ . Нейроны инфицировали через 7 дней in vitro (DIV) рекомбинантным лентивирусным вектором, экспрессирующим конструкцию mEos2-Gephyrin.

PALM визуализация

Фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) проводили на 14-17 DIV на нейронах, фиксированных 4% параформальдегидом и 1% сахарозой (10 мин).Все эксперименты по визуализации проводились на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti с иммерсионным объективом 100 × (N.A. 1.49), дополнительным объективом 1.5 × и камерой Andor iXon EMCCD. Фильмы со сверхвысоким разрешением были получены с частотой кадров 20 мс при непрерывном освещении с активационным (405 нм) и возбуждающим (561 нм) лазерами, всего 20000 кадров (6,7 минут). Плотность активации поддерживалась постоянной, вручную увеличивая интенсивность активационного лазера с течением времени. Обычную флуоресцентную визуализацию выполняли с помощью ртутной лампы и наборов фильтров для обнаружения предварительно преобразованного mEos2 (возбуждение 485/20, испускание 525/30).Положение z поддерживалось во время съемки системой идеальной фокусировки Nikon.

Обнаружение одиночных молекул и реконструкция ЛАДОНА

Координаты x и y детекций одиночных молекул из каждого кадра изображения были определены с использованием адаптированной версии алгоритма отслеживания нескольких целей [49], как описано ранее [50]. Сигналы функции рассеяния точки (PSF), испускаемые одиночными флуорофорами, соответствовали двумерному гауссовскому распределению. Дрейф в плоскости x / y был скорректирован путем расчета относительного движения центра масс нескольких кластеров синаптического гефирина (более 4 на поле зрения) на протяжении сбора данных с использованием скользящего окна в 3000-6000 кадров.Активации были сгруппированы с использованием одноканальной кластеризации с минимальным расстоянием 50 нм. Одиночные временные всплески в областях с низкой плотностью измерялись для точности определения местоположения и двойного счета, что позволяло подсчет молекул внутри кластеров. Области интересов были выбраны вручную из флуоресцентных изображений, так что для анализа концентрации по размеру были выбраны только кластеры внутри дендритов. Анализ проводили на ( n = 3) культурах.

Подгонка смоделированного распределения кластеров по размерам к экспериментальным данным

Чтобы сравнить экспериментально определенные распределения размеров кластеров с предсказанными распределениями для данного набора параметров S , мы определили вероятность данных в соответствии с (4) где n _i = A _exp c _i ( S ) – это прогнозируемое количество кластеров размером i в наблюдаемой площади поверхности A _exp для заданных параметров S и # _i – это фактически определенное количество.Вероятность вычисляется, включая размеры вплоть до наибольшего наблюдаемого размера кластера i _max . Для каждой культуры ( n = 3) мы определили вероятность по сетке значений параметров, изменяющейся скорости оборота, степени зависимости степени диффузии от размера и общей концентрации. Предполагая, что последние могут различаться между культурами, мы определили совместную вероятность для всех трех культур j = 1, 2, 3 для параметров ( k , σ ), выбрав наиболее вероятный c ₀ для каждый ( k , σ ) независимо для каждой культуры.Подборы максимального правдоподобия отдельных кластеров показаны на рис. S3. Чтобы сравнить результаты экспериментов и моделирования, мы измерили концентрации по плотности частиц каркаса в кластерах ( ρ = 5000/3 μ м ⁻² ) для экспериментов и ( ρ = 0,77 a ⁻² ) для моделирования соответственно. Мы предположили, что гефирин существует преимущественно в форме тримеров, и поэтому рассматривали тримеры гефирина как одночастичный элемент при подсчете размера кластера.Кроме того, мы ограничили сравнение прогнозируемого и фактического распределений размером кластера i ≥ 2, поскольку на счетчики более мелких кластеров больше влияют примеси и шум измерений. Прогнозируемые концентрации частиц были определены из стационарных решений скоростных уравнений, см. S1 Text: Rate Equations. Области достоверности, соответствующие 95% -ной вероятности оптимальных параметров соответствия, были получены методом бутстрэппинга с использованием повторной повторной выборки ( N = 10000) наблюдаемых кластеров для каждой из трех культур и применения вышеуказанной процедуры согласования к размеру повторно выбранных кластеров. раздачи.

Благодарности

Мы благодарим Бориса Барбура, Кристиана Шпехта, Кена Секимото и Раву А. да Силвейру за интересные обсуждения. VH также хотел бы поблагодарить Раву А. да Силвейру за стимулирование его интереса к этому вопросу и И Цуй за некоторые предварительные расчеты.

Вклад авторов

1. Концептуализация: JR LGA PCR AT VH.
2. Исследование: JR LGA PCR AT VH.
3. Writing – original draft: JR LGA PCR AT VH.

Ссылки

1. 1. Шоке Д., Триллер А. Динамический синапс. Нейрон. 2013; 80 (3): 691–703. pmid: 24183020
2. 2. Крик Ф. Нейробиология: память и молекулярный оборот. Природа. 1984; 312: 101.
3. 3. Розенберг М., Мейер Дж, Триллер А., Ванье С. Динамика вставки рецептора глицина в плазматическую мембрану нейронов. Журнал неврологии. 2001. 21 (14): 5036–5044. pmid: 11438579
4. 4. Томас П., Мортенсен М., Хози А.М., Смарт Т.Г.Динамическая подвижность функциональных рецепторов ГАМК в тормозных синапсах. Природа Неврологии. 2005. 8 (7): 889–897. pmid: 15951809
5. 5. Богданов Ю., Михельс Г., Армстронг-Голд С., Хейдон П. Г., Линдстром Дж., Пангалос М. и др. Синаптические рецепторы GABAA напрямую привлекаются из их внесинаптических аналогов. Журнал EMBO. 2006. 25 (18): 4381–4389. pmid: 16946701
6. 6. Specht CG, Izeddin I, Rodriguez PC, El Beheiry M, Rostaing P, Darzacq X и др. Количественная наноскопия тормозных синапсов: подсчет молекул гефирина и сайтов связывания рецепторов.Нейрон. 2013. 79 (2): 308–321. pmid: 23889935
7. 7. Kim EY, Schrader N, Smolinsky B, Bedet C, Vannier C, Schwarz G, et al. Расшифровка структурной основы закрепления рецептора глицина гефирином. Журнал EMBO. 2006. 25 (6): 1385–1395. pmid: 16511563
8. 8. Тягараджан С.К., Фритчи Дж. М.. Гефирин: главный регулятор функции нейронов. Nat Rev Neurosci. 2014. 15 (3): 141–156. pmid: 24552784
9. 9. Calamai M, Specht CG, Heller J, Alcor D, Machado P, Vannier C и др.Олигомеризация гефирина контролирует подвижность GlyR и синаптическую кластеризацию. Журнал неврологии. 2009. 29 (24): 7639–7648. pmid: 19535575
10. 10. Влахос А., Редди-Алла С., Пападопулос Т., Деллер Т., Бец Х. Гомеостатическая регуляция гефириновых каркасов и синаптическая сила в зрелых ГАМКергических постсинапсах гиппокампа. Кора головного мозга. 2013. 23 (11): 2700–2711. pmid: 22
11. 4
12. 11. Окабе С. Флуоресцентная визуализация формирования и ремоделирования синапсов. Микроскопия (Оксфорд, Англия).2013. 62 (1): 51–62.
13. 12. Schrader N, Kim EY, Winking J, Paulukat J, Schindelin H, Schwarz G. Биохимическая характеристика связывания с высоким сродством между рецептором глицина и гефирином. Журнал биологической химии. 2004. 279 (18): 18733–18741. pmid: 14976213
14. 13. Сола М., Бавро В.Н., Тимминс Дж., Франц Т., Рикар-Блюм С., Шон Г. и др. Структурные основы динамической кластеризации рецепторов глицина гефирином. Журнал EMBO. 2004. 23 (13): 2510–2519.pmid: 15201864
15. 14. Belaidi AA, Schwarz G. Встраивание металла в кофактор молибдена: формирование каналов продукт-субстрат демонстрирует функциональное происхождение слияния доменов в гефирине. Биохимический журнал. 2013. 450 (1): 149–157. pmid: 23163752
16. 15. Хервег Дж., Шварц Г. Сплайс-специфичное связывание рецептора глицина, сворачивание и фосфорилирование каркасного белка гефирина. Журнал биологической химии. 2012. 287 (16): 12645–12656. pmid: 22351777
17. 16.Ehrensperger MV, Hanus C, Vannier C, Triller A, Dahan M. Множественные состояния ассоциации между рецепторами глицина и гефирином, идентифицированные с помощью анализа SPT. Биофизический журнал. 2007. 92 (10): 3706–3718. pmid: 17293395
18. 17. Рибро К., Секимото К., Триллер А. От стохастичности молекулярных процессов до вариабельности синаптической передачи. Обзоры природы Неврология. 2011. 12 (7): 375–387. pmid: 21685931
19. 18. Haselwandter CA, Calamai M, Kardar M, Triller A, da Silveira RA.Формирование и стабильность доменов синаптических рецепторов. Письма с физическим обзором. 2011; 106 (23): 238104. pmid: 21770547
20. 19. Haselwandter CA, Kardar M, Triller A, da Silveira RA. Самосборка и пластичность синаптических доменов за счет механизма реакции-диффузии. Physical Review E. 2015; 92 (3): 032705.
21. 20. Бурлаков В., Эмптадж Н., Гориели А., Бресслофф П. Синаптическая бистабильность из-за зарождения и испарения рецепторных кластеров. Письма с физическим обзором.2012; 108 (2): 028101. pmid: 22324711
22. 21. Тернер М.С., Сенс П., Соччи Н.Д. Неравновесные рафтоподобные мембранные домены при непрерывной рециклинге. Письма с физическим обзором. 2005; 95 (16): 168301. pmid: 16241845
23. 22. Гомес Дж., Сагес Ф., Рейгада Р. Активно поддерживает липидные нанодомены в биомембранах. Physical Review E. 2008; 77 (2): 021907.
24. 23. Куанг БАТ, Мани М., Маркова О., Лекит Т., Ленне П.Ф. Принципы супрамолекулярной организации E-кадгерина in vivo.Текущая биология. 2013. 23 (22): 2197–2207.
25. 24. Shouval HZ. Кластеры взаимодействующих рецепторов могут стабилизировать синаптическую эффективность. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2005. 102 (40): 14440–14445. pmid: 16189022
26. 25. Белый WH. О виде стационарных решений уравнений коагуляции. Журнал науки о коллоидах и интерфейсах. 1982; 87 (1): 204–208.
27. 26. Рац З. Агрегация в присутствии источников и стоков: теория масштабирования.Physical Review A. 1985; 32 (2): 1129–1133.
28. 27. Нуссер З., Робертс Дж., Бауде А., Ричардс Дж. Г., Сомоги П. Относительные плотности синаптических и внесинаптических рецепторов ГАМКА на гранулярных клетках мозжечка, определенные с помощью количественного метода иммунного золота. Журнал неврологии. 1995. 15 (4): 2948–2960. pmid: 7722639
29. 28. Саффман П., Дельбрюк М. Броуновское движение в биологических мембранах. Труды Национальной академии наук. 1975. 72 (8): 3111–3113.
30. 29. Гамбин Ю., Лопес-Эспарза Р., Реффай М., Сиерецки Е., губернатор Н., Дженест М. и др. Боковая подвижность белков в жидких мембранах. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2006. 103 (7): 2098–2102. pmid: 16461891
31. 30. Микин П. Формирование фрактальных кластеров и сетей путем необратимой агрегации, ограниченной диффузией. Письма с физическим обзором. 1983. 51 (13): 1119–1122.
32. 31. Smoluchowski Mv.Grundriß der Koagulationskinetik kolloider Lösungen. Коллоидная и полимерная наука. 1917; 21 (3): 98–104.
33. 32. Зифф Р.М., МакГрейди Э., Микин П. О справедливости уравнения Смолуховского для кинетики кластер-кластерной агрегации. Журнал химической физики. 1985. 82 (11): 5269–5274.
34. 33. Дюмулен А., Леви С., Риво Б., Гаснье Б., Триллер А. Формирование смешанных глициновых и ГАМКергических синапсов в культивируемых нейронах спинного мозга. Европейский журнал нейробиологии.2000. 12 (11): 3883–3892. pmid: 11069583
35. 34. Помо И. Симетрия колебаний в изменении температуры. Journal de Physique. 1982. 43 (6): 859–867.
36. 35. Помо И., Ле Берр М., Жинибр Дж. Абсолютная статистическая физика: флуоресценция отдельного атома. Журнал статистической механики: теория и эксперимент. 2016; 2016 (10): 104002.
37. 36. Хайман А.А., Вебер К.А., Юлихер Ф. Разделение фаз жидкость-жидкость в биологии. Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития.2014; 30: 39–58. pmid: 25288112
38. 37. Цзэн М., Шан Й., Араки Й., Го Т., Хуганир Р.Л., Чжан М. Фазовый переход в постсинаптических плотностях лежит в основе формирования синаптических комплексов и синаптической пластичности. Клетка. 2016. 166 (5): 1163–1175. pmid: 27565345
39. 38. Brangwynne CP. Фазовые переходы и масштабирование безмембранных органелл. Журнал клеточной биологии. 2013. 203 (6): 875–881. pmid: 24368804
40. 39. Певица JH, Бергер AJ. Вклад одноканальных свойств во временной ход и амплитудную дисперсию квантовых токов глицина, регистрируемых в мотонейронах крыс.Журнал нейрофизиологии. 1999. 81 (4): 1608–1616. pmid: 10200197
41. 40. Риго Дж. М., Бадиу К. И., Лежандр П. Гетерогенность флуктуаций занятости постсинаптических рецепторов среди глицинергических ингибирующих синапсов в заднем мозге рыбок данио. Журнал физиологии. 2003; 553 (Pt 3): 819–832. pmid: 14500774
42. 41. Виттен Т.А., Сандер Л.М. Ограниченная диффузией агрегация, кинетическое критическое явление. Письма с физическим обзором. 1981. 47 (19): 1400–1403.
43. 42.Кесслер Д.А., Коплик Дж., Левин Х. Выбор модели в феномене пальчатого роста. Успехи физики. 1988. 37 (3): 255–339.
44. 43. Минерби А., Кахана Р., Гольдфельд Л., Кауфман М., Маром С., Зив НЕ. Долгосрочные отношения между синаптической устойчивостью, синаптическим ремоделированием и сетевой активностью. PLoS Biol. 2009; 7 (6): e1000136. pmid: 19554080
45. 44. Кестен Х. Случайные разностные уравнения и теория восстановления произведений случайных матриц. Acta Mathematica.1973; 131 (1): 207–248.
46. 45. Статман А., Кауфман М., Минерби А., Зив Н. Е., Бреннер Н. Динамика размера синапсов как эффективно стохастический процесс. PLoS Comput Biol. 2014; 10 (10): e1003846. pmid: 25275505
47. 46. Рубинский А, Зив NE. Ремоделирование и устойчивость тормозных синапсов: взаимосвязь с сетевой активностью и соседними возбуждающими синапсами. PLoS Comput Biol. 2015; 11 (11): e1004632. pmid: 26599330
48. 47. Татаварти V, Сан Q, Turrigiano GG.Как уменьшить постсинаптическую силу. Журнал неврологии. 2013. 33 (32): 13179–13189. pmid: 23926271
49. 48. Зита М.М., Маркионни И., Боттос Э., Риги М., Дель Сал Дж., Керубини Э. и др. Постфосфорилированная пролилизомеризация гефирина представляет собой механизм модуляции функции рецепторов глицина. Журнал EMBO. 2007. 26 (7): 1761–1771. pmid: 17347650
50. 49. Sergé A, Bertaux N, Rigneault H, Marguet D. Динамическое отслеживание нескольких целей для исследования пространственно-временной картографии клеточных мембран.Природные методы. 2008. 5 (8): 687–694. pmid: 18604216
51. 50. Изеддин I, Шпехт К.Г., Лелек М., Дарзак Х, Триллер А., Циммер С. и др. Динамическая визуализация дендритных шипов в сверхвысоком разрешении с использованием фотопреобразователя актина с низким сродством. ПлоС один. 2011; 6 (1): e15611. pmid: 21264214

Свод правил Калифорнии, раздел 8, раздел 1644. Металлические леса.

Подраздел 4. Правила техники безопасности при строительстве
Статья 22. Строительные леса – разные типы.

(a) Общие.

(1) Металлические леса должны быть спроектированы так, чтобы выдерживать все постоянные, токовые и ветровые нагрузки. которому они будут подвергаться.

(2) Нет металлических строительных лесов, сломанных или изношенных до такой степени. чтобы его сечение было конструктивно ослабленным.

(3) Все стационарные опоры лесов, включая опоры, должны опираться на на опорных плитах, предоставляемых производителем для данной услуги. Каждая база плита должна иметь опору, достаточную для выдерживания нагрузки и предотвращения горизонтального движение. Когда подмости или опоры опираются на землю или мягкий материал, опорная плита должна опираться на 2 дюйма и закрепляться на ней. Деревянное основание размером 10 на 10 дюймов.

Примечание. Кусок наружной фанеры размером 1 1/8 на 10 на 10 дюймов может использоваться вместо упомянутой выше деревянной основы.

(4) Доски платформы нельзя ставить на перила для получения большей высоты.

(5) Металлические леса должны быть надежно привязаны к зданию или строению с помощью средства железной проволоки № 12 с двойной петлей или железной проволоки № 10 с одной петлей. или эквивалент с интервалами, не превышающими 30 футов по горизонтали и при условии следующее:

(A) На свободных концах подмостей требуются стяжки, если высота платформы строительных лесов в 3 раза превышает наименьший базовый размер.Остальное стяжки первого ряда необходимы при высоте помоста лесов в четыре раза меньше минимальных базовых размеров.

(B) Стяжки для последующих уровней должны устанавливаться с интервалом в 26 футов по вертикали, последняя стяжка не должна быть дальше от вершины более чем в четыре раза меньшего размера основания.

(C) В качестве альтернативы леса должны быть закреплены растяжками или аутригеры. используется для предотвращения опрокидывания или опрокидывания.

(D) Ветровая нагрузка.Когда леса частично или полностью закрыты, специфические должны быть приняты меры предосторожности, чтобы гарантировать частоту и адекватность закрепления галстуков. строительные леса к зданию.

(6) Надежно прикрепленные перила, предоставленные производителем строительных лесов, или другой материал, эквивалентный по прочности стандартным деревянным перилам 2 на 4 дюйма изготовленные из «отборных пиломатериалов» (см. определение), должны быть установлены на открытые стороны и концы рабочих платформ на высоте 7 1/2 футов или более над уровнем земли.Вершина рельс должен располагаться на высоте не менее 42 дюймов и не более 45 дюймы измеряются от верхней поверхности верхней направляющей до уровня платформы. Промежуточный поручень должен быть предусмотрен примерно на полпути между верхним рельсом и Платформа.

Примечание. Также могут потребоваться подножки или боковые экраны. (См. Раздел 1621.)

(A) Х-образные распорки допустимы в качестве перил, если пересечение “X” находится на 45 дюймов (плюс-минус 3 дюйма) над работой. платформу, при условии, что горизонтальный рельс установлен в качестве промежуточного поручня между 19 и 25 дюймов над рабочей платформой.Максимальное расстояние по вертикали между Элементы распорки «X» на стойках не должны превышать 48 дюймов.

(B) Х-образные распорки допустимы в качестве промежуточных перил, если пересечение «X» находится на высоте от 20 до 30 дюймов над рабочей платформой.

Исключения:

(1) Перила не требуются со стороны строительных лесов каменщиков и каменщиков. рядом со строящимся объектом при условии, что стена выше, чем прилегающая рабочая площадка.

(2) Для отверстий в торцевых направляющих менее 3 футов, железная проволока с двойной обмоткой не менее Калибр № 12 по толщине или трос диаметром не менее 1/4 дюйма. допускается при условии, что трос или трос надежно закреплены.

(7) Доски платформы должны быть из материала 2 на 10 дюймов или шире и из такой длины, чтобы они перекрывали ригели с каждого конца не менее чем на 6 дюймов.

Доска не должна перекрывать свободный конец другой доски.

Рабочая площадка должна покрывать все пространство между стойками лесов, кроме открытой площадки под задними перилами.Такая открытая площадка не должна превышать 10 дюймов в ширину.

Внутренний край рабочей платформы должен находиться на расстоянии не более 16 дюймов от стена здания или сооружения, за исключением строительных лесов, используемых каменщиками и каменщики, платформы которых должны выступать в пределах 7 дюймов от отделка облицовки здания или сооружения, на которых ведутся работы.

(8) Все лестницы, используемые для доступа, должны соответствовать требованиям Статьи 25. Когда только часть ширины металлического каркаса лесов соответствует шагу лестницы, тогда эти рамы должны быть возведены таким образом, чтобы получилась непрерывная лестница. снизу вверх, с лестничными сторонами рам по вертикальной линии.

(b) Подмости для труб и муфт.

(1) На легких трубчатых и соединительных лесах должны быть все стойки, ригели, ленты. и крепления стальных труб с номинальным наружным диаметром 2 дюйма. Столбы должны быть расположены не более 6 футов друг от друга на 10 футов по длине строительных лесов. Другой конструкционные металлы при их использовании должны быть рассчитаны на эквивалентную нагрузку. Нет разнородные металлы должны использоваться вместе.

(2) Трубные и соединительные леса для средних нагрузок должны иметь все стойки, ленты и распорка номинального 2-дюймового O.D. стальные трубы. Столбы расположены не более чем на 6 футов на расстоянии 8 футов по длине лесов должны иметься ригели номинального Стальные трубки с внешним диаметром 2 1/2 дюйма. Столбы расположены на расстоянии не более 5 футов друг от друга на 8 опоры по длине лесов должны иметь ригели номинальным диаметром 2 дюйма О. D. стальные трубы. Другие конструкционные металлы, если они используются, должны быть спроектированы так, чтобы выдерживать эквивалентная нагрузка. Совместное использование разнородных металлов запрещено.

(3) Усиленные подмости для труб и муфт должны иметь стойки, ленты и распорки. номинального 2-дюймового O.D. стальные трубы с расстоянием между стойками не более 6 футов на 6 футов 6 дюймов. Другие конструкционные металлы, если они используются, должны быть спроектированы нести эквивалентный груз. Совместное использование разнородных металлов запрещено.

(4) Трубные и соединительные леса должны быть ограничены по высоте и рабочему уровню. к разрешенным в таблицах 1, 2 и 3. Чертежи и спецификации всех трубы и соединительные подмости сверх ограничений, указанных в таблицах 1, 2 и 3, должны разрабатываться инженером-строителем, зарегистрированным в настоящее время в штате Калифорния.

(5) Все подмости для труб и соединителей должны быть сконструированы и возведены для поддержки 4-кратные максимальные предполагаемые нагрузки, указанные в таблицах 1, 2 и 3, или как изложены в спецификациях инженером-строителем, в настоящее время зарегистрированным в Калифорния.

Таблица 1

Изображение 1 (1,5 “X 3,5”) Недоступно для автономной печати на STP или факс

Таблица 2

Изображение 2 (1.5 “X 3,75”) Недоступно для автономной печати на STP или факс

Таблица 3

Изображение 3 (1,25 “X 3,75”) Недоступно для автономной печати в STP или ФАКС

(6) Столбы должны быть точно расставлены, возведены на подходящих основаниях и поддержаны в надлежащем состоянии. отвес.

(7) Ленты должны быть возложены по длине подмостей, расположенные с обеих сторон. внутренние и внешние стойки на одинаковой высоте. Ленты должны быть переплетены к внутренним и внешним стойкам на одинаковой высоте.Ленты должны быть переплетены чтобы образовать непрерывные отрезки и прикрепить к каждой стойке. Нижние ленты должны располагаться как можно ближе к базе. Ленты размещать не более чем 6 футов 6 дюймов по центрам.

(8) Ригели должны устанавливаться поперечно между стойками и надежно фиксироваться. соединены со стойками, несущими на ленточном соединителе. При непосредственном соединении с ленты, соединитель необходимо держать как можно ближе к стойкам.

(9) Регистры должны быть не менее 4 дюймов, но не более чем на 12 дюймов длиннее расстояние между столбиками или лентой.

(10) Поперечные распорки должны устанавливаться по ширине подмостей не менее каждый третий комплект столбиков по горизонтали и каждую четвертую ленту по вертикали. Такой распорки должны проходить по диагонали от внутренней и внешней лент вверх до рядом внешняя и внутренняя ленты.

(11) Продольные диагональные связи на внутреннем и внешнем рядах опор должны быть установлен под углом примерно 45 градусов от основания первого наружную стойку вверх до самого верха лески.Где продольный длина лесов позволяет, такие распорки должны быть продублированы, начиная с каждый пятый пост. Аналогичным образом продольные диагональные связи также должны устанавливаться от последнего столба назад и вверх по направлению к первому столбу. Если условия не позволяют прикрепить эту распорку к стойкам, она может быть прикрепленным к ленточкам.

(c) Трубчато-сварные каркасные леса.

(1) Подмости на металлической трубчатой ​​раме, включая аксессуары, такие как распорки, кронштейны и т. Д. фермы, винтовые опоры, лестницы и т. д., должны быть спроектированы, построены и возведены чтобы безопасно выдерживать четырехкратную максимальную номинальную нагрузку. Производитель строительных лесов Инструкции по монтажу должны соблюдаться на всех установках.

(2) Расстояние между панелями или каркасами должно соответствовать прилагаемым нагрузкам.

(3) Панели или рамы должны крепиться горизонтальными связями, поперечными связями, диагональные связи или любая их комбинация для скрепления вертикальных элементов вместе по бокам, а поперечные распорки должны иметь такую ​​длину, которая будет автоматически выровняйте и выровняйте вертикальные элементы так, чтобы возведенные подмости всегда стояли вертикально, квадратные и жесткие.Все соединения распорок должны быть надежными.

(4) Ножки панели или рамы должны быть установлены на регулируемых основаниях или на простых основаниях. на грязевых порогах или другом фундаменте, достаточном для поддержки максимально ожидаемого нагрузка.

(5) Панели или рамы должны размещаться одна на другой с помощью соединения. или установочные штифты для обеспечения правильного вертикального выравнивания ножек.

Примечание: там, где промежуточный выступ предотвращает вертикальное штабелирование ножек, выступ можно использовать в качестве основания при условии получения столь же безопасной установки.

(6) Если может произойти подъем, панели должны быть скреплены вместе вертикально шпильками. или другие эквивалентные подходящие средства.

(7) Чертежи и спецификации для всех рамных лесов высотой более 125 футов над опорными плитами должны быть спроектированы инженером-строителем, зарегистрированным в настоящее время. В Калифорнии.

<Общие материалы (GM) - Ссылки, аннотации или таблицы>

Примечание: цитируемый орган: статья 142.3 Трудового кодекса. Ссылка: Раздел 142.3, Трудовой кодекс.

ИСТОРИЯ

1. Репилер и новый раздел поданы 11-14-75; эффективный тридцатый день после этого
(Регистр 75, № 46).

2. Поправка к подпункту (а) (6) подана 8-3-76 в качестве чрезвычайной ситуации; действует с
подача (регистр 76, №32).

3. Сертификат соответствия № 10-8-76 (регистр 76, №41).

4. Поправка подана 3-19-79; начиная с тридцатого дня после этого (регистр 79,
Нет.12).

5. Поправка к подпункту (а) (5), поданная 9-5-79; эффективный тридцатый день
после этого (п. 79, № 36).

6. Поправки к подпунктам (а) (4) и (а) (5), поданной 1-17-80; эффективный
на тридцатый день после этого (регистр 80, № 3).

7. Поправка к подпункту (а) (7), поданная 10-5-81; эффективный тридцатый день
после этого (регистр 81, №41).

8. Поправка подана 7-24-87; оперативная 8-23-87 (регистр 87, № 33).

9. Поправки к подпункту (а) (6) Исключения поданы 10-28-98; оперативный 11-27-
98 (регистр 98, № 44).

10. Поправка к подразделу (а) (6) (B), поданная 2-28-2006; оперативный 3-30-2006
(Регистр 2006, № 9).

Вернуться к статье 22 Содержание

Размеры платформы для строительных лесов – Как обсуждать

Какой ширины должна быть платформа для строительных лесов?

Какова минимальная ширина площадки для строительных лесов таким образом?

Итак, вопрос в том, каковы стандарты OSHA для строительных лесов?

Какое максимальное рекомендуемое расстояние между лесами и конструкцией?

Какая минимальная ширина трапа?

Какие три типа строительных лесов?

Какой вес могут выдержать леса?

Насколько высока защита от падения?

Что такое безопасная рабочая платформа?

Нужны ли строительные леса?

Насколько широкая стандартная плита для строительных лесов?

Какая максимальная скорость ветра при работе на высоте?

На какой максимальной высоте можно работать с лестницы?

Какая связь между вышками мобильных вышек?

Какая максимальная высота строительных лесов?

Кто имеет право проверять строительные леса?

Вы можете на подмостках открытого прикрепления

Вы можете?

Что нельзя использовать для поддержки строительных лесов?

Трехмерная (3D) печать каркаса и выбор материала для восстановления кости

Abstract

Восстановление костного дефекта критического размера остается серьезной проблемой в клинических условиях и требует костных трансплантатов или материалов, заменяющих костную ткань.Однако существующие биоматериалы часто не отвечают клиническим требованиям в отношении структурной поддержки, остеоиндуктивных свойств и контролируемой биоразлагаемости. Для лечения крупномасштабных костных дефектов разработка трехмерных (3D) пористых каркасов получила значительное внимание в костной инженерии. Появилось множество биоматериалов и методов производства, включая 3D-печать, для изготовления биоактивных каркасов для конкретных пациентов, которые обладают контролируемой микроархитектурой для перекрытия костных дефектов в сложных конфигурациях.В течение последнего десятилетия, с развитием индустрии 3D-печати, было создано большое количество тканевых каркасов для доклинических и клинических применений с использованием новых материалов и инновационных технологий. Таким образом, в этом обзоре представлен краткий обзор текущего прогресса в существующих биоматериалах и каркасах тканевой инженерии, подготовленных с помощью технологий 3D-печати, с акцентом на выбор материала, оптимизацию конструкции каркасов и их доклиническое и клиническое применение при восстановлении кости критического размера. дефекты.Кроме того, в нем будут подробно рассмотрены текущие ограничения и потенциальные перспективы технологии 3D-печати в будущем.

Заявление о значимости

3D-печать стала критически важным производственным процессом для костной инженерии из-за ее способности контролировать объемную геометрию и внутреннюю структуру тканевых каркасов. Развитие методов биопечати и совместимых чернильных материалов для костной инженерии стало основным направлением разработки оптимальных трехмерных каркасов для восстановления костных дефектов.

Автор: alexxlab