Трубчатые строительные леса: купить металлические трубчатые леса от 170 рублей за м2 в Москве и области

Содержание

Трубчатые рамные леса. Рамные леса с проходными рамами

Мы начинаем цикл статей, посвященный различным видам строительного оборудования для работы на высоте.

Для работы на высоте на различных строительных площадках чаще всего используются объемные трубчатые конструкции. К ним относятся леса разборные строительные приставные (ЛРСП). Также существует большое количество специализированных конструкций, таких как вышки-туры, подмости.

Чаще всего на стройках используются трубчатые леса. Изначально они изготавливались из стальной трубы, но сегодня набирают популярность алюминиевые строительные леса. Существуют различные конфигурации и размеры таких лесов.

В некоторых лесах ступени лестницы приварены к рамам (это называется рамы с лестницей). Такие лестницы неудобны для высоких лесов, в которых опорные платформы не установлены через определенные интервалы, и рабочие площадки не имеют люков.

Другие модели лесов имеют лестницы, которые крепятся к верхнему краю рамы (отвесные лестницы). Отвесные лестницы могут достигать высоты 9 метров, но уже при высоте 2.2 метров они должны иметь защитный каркас. Отвесная лестница - сплошная, и рабочие получают доступ на рабочую площадку через ограждение на уровне самой площадки. Эта лестница также неудобна при работе на большой высоте.

Еще одна модель лестниц – приставная наклонная лестница. Эта лестница невысокая и подходит для лесов, которые в высоту не превышают 2 метров. Однако при наличии нескольких таких лестниц возможно перемещение рабочих и на рамных лесах большой высоты. На рисунке показан вариант безопасного использования приставных лестниц на лесах высотой более 9 метров.

Основное преимущество рамных лесов заключается в том, что они легки в сборке, многие строительные организации знакомы с ними, а элементы лесов могут быть подняты рабочими вручную (без специального оборудования).

Леса с проходными рамами - это вариант обычных рамных трубчатых лесов. Пример показан на рисунке. Хотя изначально этот вид лесов был разработан для того, чтобы делать возможным проход людей через рамы (как правило, на улице), сейчас он очень популярен при каменной кладке, чтобы облегчить передачу строительного материала по рабочей площадке.

Размеры секции строительных лесов могут варьироваться в зависимости от размеров диагональных и горизонтальных связей. Большинство производителей предлагают секции длиной от 2 до 3 м, но наиболее популярная длина – 3 м. Работая на строительных лесах с размером секции 1 х 3 м, обратите внимание на то, что количество деревянных настилов размером 1 х 1 м на одной секции должно быть не меньше 3. При использовании лесов с шагом секции в длину 2 м увеличивается значение максимально возможной нагрузки на настил.

Не вызывает сомнения тот факт, что при монтажных высотных работах меры безопасности превыше всего. Сборка и установка строительных лесов связаны с повышенным риском.

Для всех видов строительных лесов и подмостей важным требованием является обязательное использование всех комплектующих. При отсутствии хотя бы какого-то элемента, например, связи или опоры, устойчивость строительного оборудования снижается, и может произойти несчастный случай.

Существует большое количество специальных средств обеспечения безопасности рабочих при подъеме на высотные конструкции, а также при их нахождении на рабочей площадке.

Этими страховочными средствами нельзя пренебрегать.
При монтаже и демонтаже строительных лесов следует воспользоваться услугами профессионалов, которые имеют необходимый опыт и соответствующее оборудование. Это существенно снизит риск несчастного случая при проведении работ.

Леса строительные

Главная Леса строительные

Трубчатые строительные оцинкованые леса состоят из высокопрочных труб диаметром 48 мм и длиной 2, 3, 4 и 6 метров, соединяющихся между собой стальными вставками (пальцами). Благодаря своей конструкции и техническим характеристикам, трубчатые леса Kumkang позволяют  сооружать ограждающие конструкции произвольной формы высотой до 100 метров. Сфера применения трубчатых лесов ограничена только фантазией архитекторов. Помимо использования на строительных площадках, возможно их применение, например, для создания рекламных и декоративных конструкций, при проведении концерно-массовых мероприятий, установки тентов и торговых павильонов и т.д.

Трубчатые/хомутовые строительные леса широко распространены благодаря своей универсальности, используя трубчатые строительные леса возможно возведение конструкций лесов на любом, даже самом сложном, покатом, рельефном, неровном основании, с значительным перепадом высот, т.

к. леса не имеют сформировонной геометрической формы, а собираются в жесткую форму с помощью замков (крепежей) фиксированных и поворотных. Простота монтажа трубчатых лесов так же заслуживает внимания, монтаж подразумевает минимальное количество технологических опираций с приминением минимального количества инструмента, основной объем работ заключается в установке и соединнии между собой с помощью пальца труб и фиксирования, при помощи гаечного ключа, труб между собой замками/шарнирами. Простота монтажа не требует привлечения высокоспециализированных специалистов, даже рядовой строительный разноробочий в кратчайшие сроки освоит технологию сборки хомутовых лесов и после инструктажа по технике безопасности будет готов приступить к работе.

Номенклатура труб представлена размерами 2м, 3м, 4м и 6метров. Трубы оцинкованные диаметром 48,6мм с вмонтированными крепёжными шпунтами под соеденительный палец позволяющий производить жесткое сочлинение труб по длине.

Все детали оцинкованных трубчатых лесов произведены на современном оборудовании в Южной Корее, что гарантирует высокое качество изделий и долгий срок службы конструкции в целом и каждого узла в отдельности.

Вернуться на главную страницу

 

Объявления Сахалина

Все города

Южно-Сахалинск

Александровск-Сахалинский

Анива

Быков

Вахрушев

Горнозаводск

Долинск

Ильинский

Корсаков

Красногорск

Курильск

Макаров

Невельск

Ноглики

Онор

Оха

Поронайск

Северо-Курильск

Смирных

Томари

Тымовское

Углегорск

Холмск

Чехов

Шахтерск

Южно-Курильск

Абакан

Анапа

Артём

Архангельск

Астрахань

Барнаул

Белгород

Бийск

Биробиджан

Благовещенск

Брянск

Ванино

Владивосток

Владикавказ

Владимир

Волгоград

Волжский

Вологда

Воронеж

Геленджик

Грозный

Дзержинск

Евпатория

Екатеринбург

Иваново

Ижевск

Иркутск

Казань

Калининград

Калуга

Кемерово

Керчь

Киров

Кисловодск

Комсомольск-на-Амуре

Кострома

Краснодар

Красноярск

Курган

Курск

Липецк

Магадан

Магнитогорск

Махачкала

Москва

Мурманск

Набережные Челны

Находка

Нижневартовск

Нижний Новгород

Нижний Тагил

Новокузнецк

Новороссийск

Новосибирск

Омск

Орёл

Оренбург

Пенза

Пермь

Петрозаводск

Петропавловск-Камчатский

Пятигорск

Ростов-на-Дону

Рязань

Самара

Санкт-Петербург

Саранск

Саратов

Севастополь

Симферополь

Смоленск

Сочи

Ставрополь

Стерлитамак

Сургут

Таганрог

Тамбов

Тверь

Тольятти

Томск

Тула

Тюмень

Улан-Удэ

Ульяновск

Уссурийск

Уфа

Хабаровск

Чебоксары

Челябинск

Череповец

Чита

Якутск

Ялта

Ярославль

Часто задаваемые вопросы по строительным лесам.

Компания Строительные конструкции XXI века

Почему строительные леса так называются?

Ещё в 90-е года леса строительные сбивались из досок «черновой» обработки леса, обрезков нестандартных досок и внешних спилов со ствола дерева. В обработке древесины все доски некондиционного вида отправлялись на строительные площадки. Отсюда и пошло простое название – «леса строительные».

Что такое строительные леса?

Сборные строительные леса являются вспомогательным сооружением, которое предназначается для работы на высоте. Они способны выдержать и несколько человек, - в зависимости от модели, - и все необходимые строительные материалы и инструменты.

По окончании работ что делают со строительными лесами?

Прежде, когда леса собирались из натуральной древесины, их разбирали на отдельные доски, выбрасывали треснувшие в эксплуатации доски, остальные использовались в сооружении лесов на новом объекте строительства.

Можно ли разбирать современные металлические леса?

Современные модели лесов выпускаются отдельными секциями из металлических труб разного диаметра и металлических рабочих площадок. В комплекте металлических лесов есть особые крепления, позволяющие многократно собирать и разбирать строительные леса, используя их многократно.

Чем отличаются деревянные леса от металлических?

Кроме материала и способов монтажа есть и другие отличия. Длительный срок эксплуатации, надёжность и устойчивость, привлекательный внешний вид – это основные отличия современных моделей строительных лесов по сравнению со старыми, деревянными.

Где можно использовать строительные леса?

Собираются они в любом месте, где нужно выполнить работы на высоте – и в строительстве, и в электротехнических работах. В ходе ремонта или реконструкции леса можно использовать как внутри, так и снаружи здания.

Посмотреть цены на строительные леса

Штыревые леса - надежные и мобильные.

Стойка - вертикальный элемент конструкции, который несет основную нагрузку. На металлической стойки методом полуавтоматической сварки приварены в определенном порядке трубки.

Для лесов ЛШ 50 - несущий элемент выполнен из электросварной трубы с наружным диаметром 48 мм.

Для каменных лесов ЛШ 100 - вертикальная стойка изготавливается из более прочной трубы и имеет диаметр 57 мм., толщина стенки при этом равна 3,5 мм.

Горизонтальная связь - опорный элемент лесов на который укладывают деревянные или металлические настилы. Служит связующим элементом для вертикальной стойки. На концах трубы имеются специальные крюки из прутка 18 мм.

Для лесов ЛШ 50 - изготавливается из стальной трубы с диаметром 48 мм.

Для связей ЛШ 100 используется более мощная труба, которая имеет внешний диаметр 57 мм., и толщину стенки 3,5 мм.

Настил - деревянный щит, который служит площадкой для размещения рабочих и материалов на рабочем ярусе строительных лесов. Размер такого настила составляет 1*1 метр. Поэтому может монтироваться только на конструкцию с шагом кратным одному метру.

Для фасадных лесов настил сбивается в специальную конструкцию с тремя нижними перемычками из доски 25 мм.

Для каменной кладки используется более прочная доска (толщиной 40 мм.) При необходимости настил обрабатывают огнеупорной смесью.

Подпятник - установочная пята, с которой собственно и начинается монтаж штыревых лесов. Этот элемент должен устанавливаться на подготовленную, обязательно утрамбованную площадку. Под него необходимо уложить деревянные подкладки толщиной не менее 40 мм.

Конструкция подпятника состоит из стального листа и электросварной трубы, которая четко по середине пластины приваривается с помощью полуавтоматической сварки. Диаметр трубы должен иметь меньший размер, нежели диаметр вертикальной стойки.

Анкерный кронштейн - элемент, фиксирующий вертикальную стойку к стене на определенном расстоянии.

В комплект входит две планки, которые согнуты таким образом, что бы распределить и центровать нагрузку на разрыв, и три болта.

Изготавливается данная конструкция из полосы 30*4 мм. Регулируемая длина, составляет 250-350 мм.

Поставляется в стандартный комплект лесов. Количество рассчитывается согласно ППР.

Кронштейн с хомутом - регулируемый элемент крепления конструкции штыревых лесов к зданию или другому иному сооружению, где проводятся фасадные или восстановительные работы.

Болтовой замок позволяет достаточно легко устанавливать необходимый для удобства в работе зазор между стеной и самими лесами.

В зависимости от того, какого диаметра стойки используют, подбирают хомуты для фиксации кронштейна.

Усиленный кронштейн - это элемент позволяющий устанавливать штыревые леса на расстоянии до 500 мм. от фасада здания.

Состоит из трех деталей: 1 - планка для анкера, 2 -соединяющая планка, 3 - фиксирующая скоба.

Все эти элементы имеют отверстия, которые позволяют регулировать расстояние лесов от стены.

Количество кронштейнов указано в ППР (проект производства работ)

Помост - деревянная конструкция, сбитая из досок 25 или 40 мм. (в зависимости от характера выполняемых работ) в специальный щит. Который располагается на поперечных связях штыревых лесов и служит рабочим ярусом для расположения рабочих, инструментов и строительного материала для ведения фасадных работ и кирпичной кладки.

Настил имеет специальный замок в виде ласточкиного хвоста, который предотвращает конструкцию от опрокидывания. Стандартный размер 1240*450 мм. .

Металлический настил - укладывается на поперечные связи штыревых лесов. Размеры конструкции зависят от параметров секции и от того, какие виды работ будут на них производится.

Каркас настила выполнен из стальной профильной трубы, на которую приварен пуклеванний лист с отверстиями, благодаря чему на нем не скапливается вода и не происходит обледенение.

Единственным недостатком такого настила является его цена.

Комбинированный настил - это сочетания дерева, а если быть точнее фанеры и металла.

Каркас изготавливается из профильной трубы, которая располагается на торец и сваривается в прямоугольную конструкцию. Для придания жесткости по середине вваривается перемычка.

Готовую рамку грунтуют и красят в определенный цвет. Затем обшивают фанерой толщиной не менее 12 мм. Для необходимости обрабатывают огнеупорной пропиткой.

Хомутовая стяжка- универсальный элемент который позволяет комбинировать разные виды строительных лесов между собой.

Состоит из двух оцинкованных хомутов и металлической трубы определенного размера.

С помощью такой конструкции достаточно просто обходить любые неровные участки зданий и сооружений, устанавливать штыревые леса по кругу и т. д.

Хомутовая стяжка может использоваться как диагональная распорка и придавать конструкции лесов необходимую жесткость.

Строительный домкрат - регулируемая винтовая опора которая устанавливается всместо подпятника с целью выравнивания конструкции в плоскости по горизонтали.

Кол-во домкратов заказывается согласно ППР. Устанавливать их надо так же как и подпятники на подготовленную площадку.

Диаметр резьбовой части и гайки зависит от серии лесов и характера производимых работ.

Данный элемент проходит антикоррозийную подготовку металла.

Диагональ верхняя - элемент, монтируемый в горизонтальной плоскости, служит для придания жесткости конструкции и предотвращает леса от скручивания.

Связь представляет собой металлическую трубу с двумя крюками на концах. Крюки привариваются сверху трубы, для того чтобы нижняя и верхняя связь не соприкасались между собой в плоскости.

Размеры диагональных связей зависят от габаритов устанавливаемой конструкции.

Верхняя связь - диагональная распорка служит для предотвращения заваривания лесов. Устанавливается совмесно с верхней перемычкой.

Этот элемент монтируется в самой первой секции и на самом последнем ярусе. В случае если устанавливается узкая колонна следует добавлять дополнительные диагонали.

Изготавливается связь из стальной электросварной трубы. по ГОСТу 10704

Лестница - металлическая конструкция с перемычками служащая для подъема и спуска людей и формирует лестничный марш на строительных лесах.

Состоит из двух параллельных металлических труб, которые соединяются перемычками (7 штук) которые являются в данном случае ступенями.

Количество лестничных маршей определяется согласно ППР и зависит от длинны устанавливаемы лесов.

Узел соединения - это конструкция, от которого и пошло название штыревых лесов.

На фото показано как собственно происходит соединение основных элементов между собой.

Это, пожалуй, один из самых надежных узлов который бывает в строительных лесах. Поэтому такие конструкции и применяются в основном для кирпичной кладки.

Штыревые леса - конструкция, описание, использование.

Штыревые строительные леса – это приставные стоечные трубчатые конструкции (благодаря этому их часто называют трубчатые леса), которые предназначены для осуществления отделочных и строительных работ. Штыревые леса также называют ригельными или трубчатыми. Штыревые леса имеют ряд важных преимуществ перед другими аналогами:

  • удобство в эксплуатации;
  • удобство хранения;
  • быстрая сборка/разборка;
  • мобильность;
  • прочность, надежность и долговечность;
  • широкая сфера применения.

Если говорить о недостатках, то штыревые леса достаточно неудобно использовать на сложных фасадах. Однако данный момент легко устранить, комбинируя эти конструкции с хомутовыми лесами.

Штыревые леса — описание

Эта жёсткая конструкция представляет собой соединение различных элементов: ригелей (именно поэтому их часто называют ригельные леса), стоек, башмаков, связей и пробок-анкеров. Что немаловажно, здесь не используется болтовое соединение, все элементы крепятся при помощи патрубков и крюков. Такая особенность не только увеличивает скорость монтажа и демонтажа конструкции, но также обеспечивает её высокую жесткость, что положительно сказывается на безопасности работ.

После соединения всех элементов, готовая каркасно-ярусная система крепится к стене, для чего используются металлические пробки. Также предусмотрено заземление для защиты от электрических атмосферных разрядов.

Штыревые леса нашли применение в различных областях, включая ремонтные, реставрационные, монтажные, строительные и отделочные работы на фасадах домов. Такой широкий круг решаемых задач достигается благодаря их исключительной надежности и удобством в использовании.

Если их сравнивать с другими видами лесов, например с рамными лесами, то данные изделия обладают максимальной нормативной нагрузкой из всех возможных, которая достигает 250 кг/м. Данная характеристика делает штыревые леса незаменимым инструментом при выполнении отделочных и каменно-кладочных работ. Также не стоит забывать о такой важной особенности, как устойчивость и прочность, которая гарантирует высокий уровень безопасной эксплуатации.

Монтаж

штыревых строительных лесов

Монтаж происходит в несколько этапов:

  1. Установка деревянных подкладок.
  2. Установка башмаков на эти подкладки.
  3. На башмаки монтируются стойки первого яруса.
  4. При помощи ригелей стойки компонуются в секции (отдельные элементы изделия скрепляются штырями).

Несколько слов про особенности крепления всех элементов. Первое – на конце каждого ригеля с патрубками расположены вышеозначенные штыри. Второе – ригели выполняют не только соединительную функцию. Другое их назначение – это использование в качестве лестниц, перил, ограждений и рабочего настила. Что касается необходимой жёсткости, то для этих целей используют связи, которые устанавливают в крайние секции.

Штыревые строительные леса — особенности конструкции

На деревянные подкладки устанавливаются парные башмаки и закрепляются костылями. На эти башмаки опираются стойки нижнего ряда штыревых лесов. Важный совет: если нужно повысить общую устойчивость конструкции, следует размещать стыки стоек на разных уровнях — например, в пределах самого нижнего и самого верхнего яруса чередовать двухметровые и четырёхметровые стойки. Такая система увеличит жёсткость, устойчивость и надежность штыревых лесов.

Что касается промежуточных ярусов, то здесь наращивание допустимо только с использованием четырёхметровых стоек. Стойки (при помощи ригелей) должны монтироваться таким образом, чтобы в результате получилась пространственная конструкция. Классическим методом считается их соединение со стеной при помощи двойных или одинарных крюков, либо анкеров.

Составляющие элиемнты штыревых лесов:

Строительные леса - это... Что такое Строительные леса?

Строительные леса на фасаде здания

Строительные леса — временное вспомогательное сооружение для размещения рабочих или материалов при выполнении строительных, монтажных и других работ. Применяются как снаружи, так и внутри здания. Чаще всего строительные леса собираются из унифицированных металлических и деревянных элементов.

В прошлом использовались допускавшие лишь однократное применение строительные леса из круглого или вчерне обработанного леса — откуда они и получили своё название.

В конструктивном отношении современные строительные леса представляют собой пространственную каркасную систему, выполненную из стандартных металлических элементов, что допускает их использование независимо от очертаний сооружений и рельефа местности.

Типы

Существуют следующие типы строительных лесов:

Рамные леса

Предназначены для строительных и монтажных работ любой сложности. В основе конструкции таких лесов лежит пространственный металлический каркас из вертикальных рам, соединённых между собой горизонтальными и диагональными связями, закреплёнными на рамах при помощи флажковых замков. Преимущества рамных лесов - это небольшой вес, лёгкость монтажа. Недостатки рамных лесов - невозможность монтажа на фасадах со сложной геометрией.

Клиновые леса

Данный тип лесов получил своё название благодаря особому способу крепления элементов – клиновое соединение. Клиновые леса имеют простую конструкцию, в состав которой входят диагональные и горизонтальные элементы, вертикали, лестницы, настилы.
Вертикальные элементы таких лесов представляют собой трубу, на которой установлены фланцы круглой формы с отверстиями.
Горизонтальные элементы представляют собой трубу с приваренными держателями на концах. Держатель состоит из элемента с отверстием и клина. Диагональный элемент состоит из трубы, сплющенной на концах и поворотного держателя с клином. Клиновые или леса клиночного типа надёжны, обладают высокими несущими способностями, способны выдерживать помимо рабочих с материалами и необходимую стройтехнику, инструменты, просты в монтаже и демонтаже. Данная конструкция лесов несмотря на свою технологичность обладает минимальным воздействием на здание (по сравнению с другими видами лесов), что позволяет с успехом использовать приставные клиновые леса при реставрационных работах. Также клиновые леса применяются: при ремонтно-строительных работах домов и в кораблестроении, при отделочных работах, при выполнении кирпичной кладки, при организации концертных площадок и сцен для шоу-программ. Помимо этого строительные леса могут быть использованы как каркасная система для монолитной опалубки. Есть распространённое мнение, что данный тип лесов нельзя использовать на объектах со сложной геометрией, но это не совсем так. Для устройства лесов на зданиях сложной геометрии необходимо дополнительно использовать хомуты лесов и стандартные элементы клиновых лесов. Благодаря этому скорость монтажа по сравнению с хомутовыми вырастает в несколько раз. Ведь даже на сложных объектах не так много кривоугольных площадей.

Штыревые леса

Это не самый распространённый тип строительных лесов. В собранном положении представляют собой металлоконструкцию, состоящую из стоек, ригелей, связей, башмаков и узлов соединений. Данный тип лесов был распространён в советское время, благодаря простоте производства и незамысловатой конструкции. Для его изготовления требуется только труба и пруток определённого диаметра. Минус - на их монтаж идёт много металла и соответственно они тяжелее других типов лесов, плюс - выдерживают большие нагрузки (например при каменной кладке).

Башенные(передвижные) леса или вышки-туры

(строительные туры) Разновидность рамных строительных лесов, в которых несколько секций, поставленных друг на друга, размещены на передвижном основании.

Хомутовые леса

Такие леса считаются универсальными, но чаще всего используются именно для сложных объектов. Хомутовые леса не имеют строгих геометрических размеров, в связи с этим можно устанавливать различный шаг стоек, менять ярусную высоту, менять размеры рабочей зоны. Данные леса применяются для зданий и сооружений с нестандартной конфигурацией. Форма данных лесов меняется в широких пределах, как в плане, так и по высоте. Крепление между элементами лесов осуществляют при помощи поворотных и неповоротных хомутов. В настоящее время в России хомутовые леса постепенно вытесняются рамными и клиновыми лесами.

Чашечные леса (Cup Lock)

Стандарты

  • ГОСТ 24258—88 Средства подмащивания.
  • ГОСТ 27321—87 Леса стоечные приставные для строительно-монтажных работ.

Литература

Трубчатые леса - ведущий производитель строительных лесов

Трубчатые леса - это строительные леса как для внутренних, так и для наружных работ, изготовленные из стальных труб. Трубчатые подмости легкие, обладают низкой ветроустойчивостью, легко собираются и разбираются. Они доступны в нескольких вариантах длины для разной высоты и различных видов работ. Система трубчатых лесов или трубчатых лесов - это леса, состоящие из оцинкованных алюминиевых или стальных труб, соединенных между собой сцепкой, которая опирается на трение для поддержки нагрузки.

В традиционной системе трубчатых лесов максимальная превышающая рабочая нагрузка должна быть в пределах 10 кН с довольно низким коэффициентом безопасности. Монтажная высота строительных лесов должна быть не более 30 метров, а при высоте более 30 метров рамы должны быть выполнены из двух труб.

ADTO Mall является ведущим производителем трубчатых строительных лесов , мы специализируемся на поставке, проектировании и управлении решениями строительных лесов для широкого круга клиентов, независимо от того, какие простые работы или крупномасштабные сложные проекты.Как опытный поставщик строительных лесов , инновации лежат в основе нашего бизнеса, что позволяет нам предоставлять вам решения для доступа, адаптированные к вашим потребностям. ADTO Mall предлагает на продажу высококачественные трубчатые леса, которые заслужили признание во всем мире за долговечность и эффективность трубчатых лесов. Мы пользуемся заслуженным доверием в индустрии строительных лесов, и вы можете положиться на наши продукты и услуги в области строительных лесов, чтобы максимально повысить вашу производительность и эффективность. Все наши строительные леса по контракту, продаже и аренде тщательно проверяются на качество и спроектированы в соответствии с международными стандартами и правилами.

Применение трубчатых лесов:


Трубчатые леса - это самый универсальный тип строительных лесов, который можно адаптировать ко всем типам строительных конструкций, например: отдельно стоящие подмости, независимые привязные подмости, подмости для клеток для птиц, стропильные подмости, подвесные подмости, вышки и подвесные подмости.

Преимущества трубчатых лесов:


1. Простота использования. Эти подмости просты в использовании (требуются только четыре основных компонента, такие как труба, угловая муфта, поворотная муфта, основания или ролики).
2. Долговечность. Эти типы строительных лесов долговечны (оцинкованные трубы способны выдерживать суровые условия окружающей среды).
3. Легкость сборки и разборки. Трубчатые леса очень легко собираются и разбираются, что позволяет сэкономить время на месте.
4. Легкий вес. Система труб и фитингов имеет небольшой вес, благодаря чему строительные леса можно легко перемещать по строительной площадке.
5. Адаптивность. По сравнению с другими лесами, строительные леса с системой труб и фитингов предлагают наиболее гибкие и эффективные решения для строительных лесов.
6. Экономическая эффективность. В случаях, когда строительные леса необходимо возводить в течение длительного периода времени (более четырех недель), строительные леса с системой труб и фитингов обеспечивают наиболее экономичное решение для строительных лесов.
7. Гибкость. Трубчатые леса - один из самых гибких видов строительных лесов. Эти подмости можно регулировать по желаемой высоте.
8. Увеличенная продолжительность жизни. Трубчатые строительные леса имеют более длительный срок службы по сравнению с другими лесами и предлагают более прочные рабочие платформы.

ИНЖЕНЕР-СТРОИТЕЛЬ: Трубчатые леса

Подмости ~ это временные рабочие площадки, возводимые по периметру здания или сооружения для обеспечения безопасного рабочего места на удобной высоте. Обычно они требуются, когда рабочая высота или уровень составляет 1 500 или более над уровнем земли. Все строительные леса должны соответствовать минимальным требованиям и целям Правил проведения высотных работ 2005 г.

Составные части трубчатых лесов ~


Леса Putlog ~ это леса, которые имеют внешний ряд стандартов, соединенных вместе ригелями, которые, в свою очередь, поддерживают поперечные заглушки, которые встраиваются в стыки станины или перпендикулярны по ходу работы, поэтому они подходят только для новых работ в кирпичи или блоки. Независимые подмости ~ это подмости, которые имеют два ряда опор, каждый ряд соединен вместе с ригелями, которые, в свою очередь, поддерживают поперечные поперечины. Строительные леса возводятся вне существующего или предполагаемого здания, но привязаны к зданию или конструкции через подходящие интервалы.
Рабочие платформы ~ это закрытые или обшитые покрытиями ровные поверхности на высоте, на которой выполняются работы, и они должны обеспечивать безопасное рабочее место с достаточной прочностью, чтобы выдерживать нагрузку на рабочих и / или материалы.Все рабочие площадки над уровнем земли должны быть оборудованы бортиком и ограждением. Привязка ~ Все путы и независимые леса должны быть надежно привязаны к зданию или конструкции на разной высоте подъема по вертикали и не более чем на 6 000 центров по горизонтали.

Путлоги не следует классифицировать как галстуки. Подходящие методы обвязки включают соединение с трубками, установленными между сторонами оконных проемов, или с внутренними трубками, установленными через оконные проемы, первый метод не следует использовать для более чем 50% от общего количества стяжек.При недостаточном количестве оконных проемов для необходимого количества стяжек следует использовать внешние рейки.

Передвижные подмости ~ , также известные как передвижные вышки-подмости. Они могут быть собраны из предварительно сформированных компонентов каркаса или из стандартных труб и фитингов для строительных лесов. Используется в основном для обслуживания недвижимости. Запрещается перемещать, когда в нем находятся люди или оборудование.
Некоторые базовые детали ~

трубчатые леса Сингапур | Часть строительных лесов на продажу и в аренду

Как следует из названия, трубчатые леса - это временные конструкции, возводимые из оцинкованных стальных или алюминиевых труб.Эти трубы удерживаются вместе с помощью соединительных элементов каркаса для поддержки различных рабочих нагрузок. Большинство частей этого типа строительных лесов построено из металлических элементов и досок, чтобы обеспечить стабильную и безопасную платформу для рабочих.

Трубчатые леса сооружаются по периметру или на внешних частях конструкции, чтобы обеспечить удобную платформу на необходимой высоте. Этот тип строительных лесов рекомендуется при работе на высоте 1500 м и более над землей. Тем не менее, по-прежнему важно, чтобы вы знали некоторую важную информацию о трубчатых лесах, чтобы определить, подходят ли они для вашего проекта.

Компоненты трубчатых лесов

Существуют различные виды основных элементов и принадлежностей строительных лесов, которые используются при устройстве трубчатых лесов. Возможно, вы не сможете узнать все из них, но ниже приведены некоторые основные, которые важно принять к сведению;

Металлические трубы / трубки

Это основные компоненты строительных лесов этого типа, которые в основном изготавливаются из стальных или алюминиевых труб или трубок. Трубы бывают разных размеров и свойств, подходящие для выдерживания больших нагрузок и движения, возникающих при работе.Лучшие трубы для строительных лесов оцинкованы и имеют специальную обработку поверхности для увеличения прочности и срока службы. Кроме того, вы также должны убедиться, что приобретаемые вами пробирки соответствуют соответствующим стандартам.

Муфты для строительных лесов

Также известные как зажимы, соединители - это основные компоненты строительных лесов, используемые для соединения каркасов конструкции. В основном они используются для создания угла для правильного выравнивания подмостей. Существуют различные виды соединителей, которые вы можете выбрать для установки трубчатых лесов, в том числе угловые соединители, шарнирные соединители, соединители путлог, соединители рукавов, соединители и другие.Профессионал может помочь вам выбрать лучшие соединители для вашей конструкции.

Доски / доски

После того, как конструкция установлена, возводятся доски или доски, чтобы дать рабочим поверхность или платформу для работы. Доски всегда должны быть достаточно прочными, чтобы выдерживать вес рабочих, строительных материалов и их инструментов. Учитывая, что эти компоненты испытывают постоянное движение по мере того, как рабочие переходят с одной станции на другую, их следует регулярно проверять на предмет изгибов, скручиваний или других повреждений, чтобы гарантировать безопасность строительных лесов.Кроме того, они также обычно проходят испытания и одобряются перед использованием, чтобы работники не подвергались риску.

Трубчатые компоненты строительных лесов могут быть горизонтальными, вертикальными или наклонными, в зависимости от конструкции конструкции или вида работ, которые над ней будут проводиться. Другие компоненты строительных лесов, используемые при установке трубчатых лесов, включают, среди прочего, распорки, опорные плиты.

Преимущества трубчатых строительных лесов

Учитывая прочную конструкцию основных компонентов трубчатых лесов, их можно использовать практически во всех видах строительных проектов как новых, так и существующих.Ниже приведены некоторые из преимуществ использования этого типа строительных лесов в вашем проекте.

Простота установки и разборки

Трубчатые леса состоят из минимального количества компонентов, что обеспечивает простую и быструю установку без необходимости привлечения профессиональных услуг по монтажу строительных лесов. Это может существенно сэкономить время на возведение или демонтаж конструкции, а также сэкономить ненужные расходы. Кроме того, трубы и рамы, используемые при установке этого типа строительных лесов, также имеют легкий вес и могут быть легко собраны, разобраны и перемещены с одного рабочего места на другое.

Очень прочный

Трубчатые леса возводятся из оцинкованной стали, алюминия и других прочных компонентов, которые могут выдерживать комбинации рабочих нагрузок и давления на строительных площадках. Кроме того, материалы, используемые при строительстве этой конструкции, способны выдерживать использование в различных погодных условиях, не подвергаясь сильной ржавчине или коррозии. Даже при сильном давлении и весе основным компонентам очень трудно изгибаться или смещаться.

Универсальный

Трубчатые леса - один из самых универсальных типов строительных лесов, так как они могут быть легко отрегулированы до различных уровней в соответствии с требованиями рабочих.Это делает его идеальным для более удобного выполнения различных видов проектов. Фактически, трубчатые леса можно приспособить практически к любому строящемуся зданию или конструкции. Некоторые из популярных типов трубчатых лесов - это отдельно стоящие и башенные леса.

Трубчатые леса также можно легко отрегулировать до различного уровня в соответствии с потребностями рабочих, что делает их очень удобными в широком спектре строительных проектов. Кроме того, строительные леса также могут быть легко установлены на роликах.В результате такой гибкости трубчатые леса сегодня становятся идеальным выбором для многих людей в строительной отрасли.

Экономичный

Еще одно преимущество трубчатых лесов в том, что это более экономичный вариант. Во-первых, это можно отнести к минимальным составляющим конструкции. Поскольку установить эти строительные леса также довольно просто, их использование в вашем проекте может стать отличным способом сэкономить на общих расходах. Кроме того, долговечность компонентов строительных лесов означает, что конструкция не требует особого обслуживания и, следовательно, снижает эксплуатационные расходы.

Как получить лучшие трубчатые леса

Несмотря на кажущуюся простую конструкцию трубчатых лесов, на рынке есть разновидности строительных лесов, из которых вы можете выбирать. Поэтому также важно знать, как выбрать наиболее подходящую конструкцию или модель трубчатых лесов для вашего проекта и бюджета. Помимо использования информации, представленной в Интернете, запрос в профессиональной компании по производству строительных лесов может быть наиболее удобным вариантом при поиске трубчатых строительных лесов.

Singapore Scaffolding предлагает широкий ассортимент трубчатых лесов высшего качества, которые вы можете приобрести для любого строительного проекта. Мы также можем поставить трубчатые леса по индивидуальному заказу, адаптированные к конкретным требованиям клиентов. Наша компания ориентирована на предоставление высококачественных, высокоэффективных и самых доступных продуктов и услуг в области строительных лесов в Сингапуре.

Если вы хотите узнать о лучших трубчатых строительных лесах для продажи или аренды, не стесняйтесь обращаться к нам.

HDB Зарегистрированный подрядчик
Номер лицензии: HB-09-5474D

Забавная трубчатая система строительных лесов на все случаи жизни

Выберите из беспрецедентного множества. трубчатая система строительных лесов на Alibaba.com. Эти предметы отлично подходят для таких случаев, как Хэллоуин, тематические вечеринки и даже для посещения тематических парков. Файл. Трубчатые леса на площадке производятся надежными брендами, которые используют высококачественные материалы и производят качественную продукцию.Эти. Система трубчатых лесов доступна во всех размерах, от миниатюрных до больших. Эти предметы невероятно интересны как детям, так и взрослым.

Трубчатая система строительных лесов на Alibaba.com включает в себя повязки на голову, одежду и предметы, которые вызывают ощущение определенных персонажей и точно представляют их. Файл. Система трубчатых лесов , предлагаемая на сайте, включает обычных мифологических существ, телевизионных персонажей, супергероев и книжных персонажей.Эти. Система трубчатых лесов бывает забавной и необычной, а также пугающей в зависимости от случая, для которого они предназначены. Они доступны в вариантах, которые подходят как подарки для кляпов, так и гиперреалистичные, которые могут быть использованы косплеерами и теми, кто хочет создавать реалистичные костюмы. Их могут использовать, в частности, сотрудники парков развлечений и организаторы вечеринок по случаю дня рождения.

Система трубчатых лесов , доступная на строительной площадке, тщательно продумана, чтобы быть безопасной для всех.Они изготовлены из качественных материалов, не вызывающих повреждений и зуда. Эти. Система трубчатых лесов удобна в носке и проста в использовании. Файл. Система трубчатых лесов предлагается в различных привлекательных и ярких дизайнах, которые обязательно будут привлекать внимание.

Поднимите свое чувство стиля и веселье с помощью забавного и привлекательного. трубчатая система строительных лесов от Alibaba.com. Эти предметы идеально подходят для. трубчатых строительных лесов поставщиков, желающих закупить большие партии оптом.По очень доступным ценам эти товары обязательно понравятся покупателям.

Изготовление трубчатых сердечных конструкций без каркасов с использованием принтера Bio-3D

Abstract

Основной проблемой в инженерии сердечной ткани является иммунный ответ организма на искусственные материалы. Чтобы преодолеть эту проблему, мы создали систему без каркасов для сборки клеточных конструкций с помощью автоматического принтера Bio-3D. Этот принтер ранее использовался для изготовления других трехмерных (3D) конструкций, включая печень, кровеносные сосуды и хрящи.В настоящем исследовании мы протестировали функцию in vivo сердечной трубчатой ​​конструкции без каркаса, изготовленной с использованием этой системы. Кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iCells), эндотелиальных клеток и фибробластов, были объединены для образования сфероидов. Впоследствии трубчатые сердечные конструкции были изготовлены на принтере Bio-3D, поместив сфероиды на набор игл. Примечательно, что слияние сфероидов и частота биений в конструкциях наблюдались, пока они еще находились на массиве игл.После удаления из набора игл, электрическая стимуляция использовалась для проверки чувствительности конструкций. Во время стимуляции наблюдалась повышенная частота сердечных сокращений. Важно отметить, что конструкции вернулись к своей начальной частоте сердечных сокращений после прекращения стимуляции. Кроме того, гистологический анализ показывает клеточную реорганизацию, происходящую в сердечных конструкциях, которая может имитировать реорганизацию, наблюдаемую во время трансплантации органов. Взятые вместе, наши результаты показывают, что эти сконструированные сердечные трубчатые конструкции, которые направлены как на ограниченное количество донорских тканей, так и на иммуно-индуцированное отторжение трансплантата, могут быть использованы как для клинических исследований, так и для тестирования лекарств.Насколько нам известно, это первый случай, когда сердечные трубчатые конструкции были изготовлены с использованием оптимизированной технологии био-3D-печати и впоследствии протестированы для их использования в качестве сердечных насосов.

Образец цитирования: Араи К., Мурата Д., Вериссимо А.Р., Мукае Й., Ито М., Накамура А. и др. (2018) Изготовление трубчатых сердечных конструкций без каркасов с использованием принтера Bio-3D. PLoS ONE 13 (12): e0209162. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162

Редактор: Мичия Мацусаки, Осака Ширицу Дайгаку, ЯПОНИЯ

Поступила: 11 мая 2018 г .; Дата принятия: 2 декабря 2018 г .; Опубликовано: 17 декабря 2018 г.

Авторские права: © 2018 Arai et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом для молодых ученых (B) (№ 16K19968) Японского общества содействия развитию науки в Калифорнии.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Соавтор К. Накаяма является соучредителем и акционером Cyfuse Biomedical KK. и инвестор / разработчик, указанный в патенте на принтер Bio-3D. Название патента: Способ получения трехмерной структуры клеток; номер патента: JP4517125. Название патента: Устройство для производства клеточной структуры; номер патента: JP5896104.Другие авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует. Это не влияет на соблюдение авторами политики PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

1. Введение

Сердечная недостаточность является ведущей причиной смерти во всем мире, и трансплантация органов используется как эффективный терапевтический метод при терминальной стадии сердечной недостаточности [1–3]. К сожалению, доступность органов остается серьезной проблемой, особенно потому, что число пациентов с сердечной недостаточностью в последние годы неуклонно растет.Кроме того, пагубные последствия иммуносупрессивного лечения, необходимого для успешной трансплантации органов, также вызывают озабоченность [4]. Хирургические вмешательства, такие как имплантация желудочковых вспомогательных устройств, могут использоваться для обхода некоторых известных проблем с трансплантацией органов, но только у ограниченного числа пациентов [5]. Однако эти процедуры связаны с другими рисками, связанными с операцией, такими как образование тромбов, кровотечение, инфекция и неисправность устройства [6].

Недавние достижения в технологии тканевой инженерии значительно улучшили трансплантацию органов, так как человеческие ткани и органы для медицинских применений теперь могут изготавливаться in vitro с использованием человеческих клеток [7].Действительно, различные типы клеток были оценены на предмет их использования в тканевой инженерии, однако наше внимание привлекают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), которые могут дифференцироваться в функциональные кардиомиоциты [8–12] и обладают особенностями, которые делают их биосовместимыми, функциональными и безопасными для долгосрочное клиническое применение.

Чтобы получить наиболее желаемую трехмерную (3D) конструкцию, отвечающую всем необходимым характеристикам сконструированной сердечной ткани, были оценены две основные техники: на основе каркаса и без каркаса.

Инженерия сердечной ткани на основе каркасов полезна, поскольку она обеспечивает основу для построения трехмерной среды и может помочь модулировать определенные функции сердца. Несколько групп изготовили сердечные конструкции из смесей гидрогелей, таких как матригель и коллаген, и клеток сердца крыс [13,14]. Кроме того, когда к этим конструкциям применялась электрическая стимуляция в течение 5 дней, сконструированная сердечная ткань проявляла повышенный инотропный резерв. Однако у этой техники есть несколько недостатков.Например, материалы, используемые для сборки конструкций на основе каркаса (например, коллаген), являются иммуногенными. С помощью этих методов также трудно воспроизвести естественную микроструктуру и механические свойства сердца in vitro [15].

Альтернативно, тканевая инженерия без каркасов также была исследована в отношении трансплантации органов. Например, клеточные листы являются одним из самых передовых методов в области тканевой инженерии [16] и используются для различных клинических применений, включая восстановление повреждений сердца [17,18].Sekine и др. сообщили об улучшении сердечной функции после трансплантации сконструированных пластов сердечных клеток [19]. Хотя клеточные листы одновременно эффективны и универсальны, эта технология ограничивала толщину трехмерной сердечной конструкции только до 200 мкм. Другой метод без каркасов - это использование 3D-биопечати в качестве шаблона для создания 3D-тканей. Недостатком этой техники является то, что конструкции, созданные с использованием биобумаги, такой как агарозный гель [20], трудно удалить после изготовления конструкции, поскольку с помощью этой системы изготавливаются сложные формы.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали новую технологию био-3D-печати, в которой клетки объединяются в сфероиды, которые затем могут быть напечатаны на массиве игл в соответствии с желаемым 3D-дизайном. Благодаря полностью свободной от каркасов среде слияние сфероидов можно наблюдать в любой точке. Впоследствии конструкции могут быть удалены из набора игл и выдержаны в биореакторе. Noguchi и др. [21] в своем исследовании показали изготовление кардиальных пластырей без каркаса с использованием сердечных сфероидов.После применения in vivo кардиальных пластырей без каркасов, напечатанных на биотрёхмерном изображении, Ong и др. [22] наблюдали усиление васкуляризации и приживления пластыря. Хотя использование этих 3D-печатных тканей становится все более широко распространенным в области тканевой инженерии, все еще существует ряд применений, которые не были исследованы в отношении трансплантации органов при лечении сердечной недостаточности и повреждений. Кроме того, Sekine и др. [23] сообщили о трансплантации пульсирующих миокардиальных трубок, изготовленных из клеточных пластов.Трансплантация листов сердечных клеток крысы вокруг брюшной аорты привела к изменению внутреннего давления, вызванному их сокращением. Seta и др. [24] сообщили о применении изготовленных трубчатых сердечных тканей человека, полученных из iPS-клеток, на нижнюю полую вену крыс.

В настоящем исследовании мы изготовили трубчатую сердечную конструкцию без каркаса, которая функционирует как сердечный насос. Наш анализ включает оптимизацию условий сборки сердечного сфероида, а также электрическую стимуляцию напечатанных трубчатых сердечных конструкций.Насколько нам известно, это первый случай, когда сердечные трубчатые конструкции были изготовлены с использованием этой технологии био-3D-печати и впоследствии протестированы для их использования в качестве сердечных насосов.

2. Материалы и методы

2.1. Культура клеток

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) и нормальные дермальные фибробласты человека (NHDF) были приобретены у Lonza, Inc. (Walkersville, MD, USA) и культивированы в EBM-2 и FBM-2. Оба типа клеток культивировали при температуре 37 ° C, 5% CO 2 .Кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека (iCells), были приобретены у Cellular Dynamics International, Inc. (CDI, Мэдисон, Висконсин, США) [25,26]. iCell размораживали и культивировали в соответствии с инструкциями производителя. Криоконсервированные кардиомиоциты iCell размораживали в течение 4 минут на водяной бане при 37 ° C, разбавляли в среде для посева iCell (CDI) и использовали для образования сфероидов.

2.2. Формирование сердечного сфероида

iCell, HUVEC и NHDF суспендировали и смешивали в нескольких соотношениях (таблица 1) и высевали в 96-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением (SUMITOMO BAKELITE, Токио, Япония) с образованием сердечных сфероидов, содержащих в общей сложности по 35000 клеток каждый.Культуральные среды, специфичные для каждого типа клеток, объединяли в той же пропорции, что и соответствующие клетки для различных смесей. Сфероиды культивировали в инкубаторе с влажностью 37 ° C, 5% CO 2 . Через 2 дня среду меняли с среды для посева iCell на поддерживающую среду iCell, а затем меняли каждые 2 дня. Сформированные сердечные сфероиды были использованы для дальнейшего анализа и изготовления сердечных конструкций. Размер и округлость сердечных сфероидов измеряли с помощью программного обеспечения принтера Bio-3D.Формула, использованная для расчета округлости сердечных сфероидов, была следующей. Ставка круга (%) = 100- (R-r) / R × 100. А «R» - радиус минимальной описанной окружности, «r» - радиус вписанной окружности.

2.3. Изготовление кардиальных конструкций без каркасов с использованием био-3D-принтера

Био-3D-принтер (Cyfuse Biomedical K.K., Токио, Япония) был использован для сборки сердечных сфероидов в сердечные конструкции без каркаса. О методе, используемом для изготовления этих конструкций, сообщалось ранее [27], а на рис. 1 представлена ​​диаграмма, которая включает трехмерные конструкции трубчатой ​​конструкции (рис. 1B).Конструкции были изготовлены с использованием 7-дневных сердечных сфероидов (рис. 1A) и культивированы на наборах игл в течение дополнительных 7 дней (рис. 1D). После извлечения из набора игл сердечные трубчатые конструкции культивировали на пластиковых катетерах 22 размера (Terumo, Tokyo, Japan) в биореакторе в течение 7 дней с последующей фиксацией и анализом.

Рис. 1. Процесс био-3D-печати.

Клетки собираются в сфероиды (A). Требуемый трехмерный дизайн составляется с использованием программного обеспечения набора игл (B), после чего выбирается и подготавливается соответствующий набор игл (C).Затем сфероиды печатаются на массиве игл (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g001

2,4. Гистологический и иммуногистохимический анализ

Сердечные сфероиды и конструкции фиксировали в 10% нейтральном буферном растворе формалина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Осака, Япония) в течение 48 часов при 4 ° C. После фиксации образцы трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), заливали парафином и разрезали на срезы 5 мкм.Затем эти срезы окрашивали гематоксилином и эозином и использовали для иммуноокрашивания. Первичные антитела против тропонина Т (разведение 1: 100; MS-295-P0, Thermo Fisher Scientific, Inc., Массачусетс, США), CD31 (разведение 1:75; NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Ветцлар, Германия), и CD90 (разведение 1: 100; ab92574, Abcam Plc., Кембридж, Великобритания). Для подтверждения жизнеспособности клеток проводили анализ TUNEL с использованием набора для определения гибели клеток in situ (Roche Applied Science, Penzberg, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.После депарафинизации и гидратации с помощью градиента этанола срезы обрабатывали 0,3% (об. / Об.) Раствором H 2 O 2 в течение 10 мин. Затем их дважды промывали трис-буферным физиологическим раствором (TBS) и инкубировали с первичным антителом, разведенным в блокирующем растворе, при 4 ° C в течение ночи. После двукратной промывки TBS образцы инкубировали с вторичным антителом при комнатной температуре в течение 30 мин, дважды промывали TBS и обрабатывали раствором DAB (Agilent Technologies Japan Ltd, Токио, Япония).После монтажа срезы наблюдали и отображали с помощью микроскопа BZ-X700 (Keyence, Осака, Япония).

2,5. Анализ сокращения

Мы разработали собственное программное обеспечение для анализа, которое может распознавать и измерять изменения в области сердечного сфероида с помощью видеозаписей (рис. 2). Это программное обеспечение также использовалось для анализа частоты сердечных сокращений и сократительной активности конструкций. Каждый кадр записанных видеороликов был преобразован в двоичный формат и использован для расчета площади сужения (рис. 2A и 2B).Изменения фракционной площади рассчитывались как сокращенная площадь / минимальная площадь (рис. 2С). Видео записывали с помощью цифровой камеры (Leica MC120 HD, Leica Biosystems, Wetzlar, Германия), установленной в инвертированном светлом поле (Leica DMi1, Leica Biosystems, Wetzlar, Германия), или стереоскопического микроскопа SZX7 (Olympus, Токио, Япония). Кардиальные сфероиды были записаны и проанализированы через 10 дней культивирования.

Рис. 2. Анализ движения сократительной области в сердечных сфероидах и конструкциях.

Регистрировали величину каждого сокращения сердечных сфероидов и конструкций и выделяли отдельные рамки (A). Затем измеряли площадь сфероида и конструкции в каждом кадре с помощью нашего собственного программного обеспечения (B). Относительные изменения площадей сфероидов и конструкций были рассчитаны и нанесены на график (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g002

2,6. Электростимуляция

После 14 дней культивирования (день печати установлен как день 0) сердечные конструкции были перенесены в камеру с двумя платиновыми стержнями, подключенными к устройству электростимуляции (рис. 3A).На рис. 3В показана электронная схема этой системы. Для стимуляции сердечной конструкции в качестве источника питания использовали PSW 80–13,5 (Good Will Instrument Co., Ltd, Нью-Тайбэй, Тайвань) в сочетании с компьютерной программой Arduino Uno. Схема электрической установки показана на рис. 3C. Конструкции стимулировали биполярными электрическими импульсами 20 В и 2 Гц, которые длились 10 мс и повторялись каждые 490 мс. После стимуляции данные были проанализированы с помощью аналитического программного обеспечения, разработанного собственными силами.

Рис. 3. Система электростимуляции.

Принципиальные схемы системы электростимуляции (А) и электрической цепи (Б). Электростимулятор генерирует импульсы, которые затем передаются среде в чашке. Для изображения конструкций образцы помещали между платиновыми электродами, и всю систему помещали на микроскоп (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g003

3. Результаты

3.1.Характеристика сердечных сфероидов, содержащих iCell, эндотелиальные клетки и фибробласты

Клетки высевали на планшеты со сверхнизким прикреплением, и образование сердечного сфероида наблюдали на 1, 2, 5 и 7 дни (рис. 4). После 3 дней культивирования различные смеси клеток начали агрегировать с образованием сердечных сфероидов, которые имели стабильную округлость в течение 5 дней. Примечательно, что суспензии, содержащие 100% iCells, образовывали сфероиды только после 7 дней культивирования. Кроме того, размер и округлость смешанных клеточных сфероидов со всеми тремя типами клеток показали большую однородность на 7 день, примерно 600 мкм и 80%, по сравнению со сфероидами, состоящими только из iCell (рис. 5).Эти данные показывают, что добавление фибробластов и эндотелиальных клеток способствует быстрой самоорганизации клеток и повышает стабильность сердечного сфероида в отношении формы и размера.

Рис. 4. Покадровая съемка формирования сердечного сфероида.

Были приготовлены сердечные сфероиды, содержащие различное процентное содержание iCell, HUVEC и NHDF, и процесс их образования был визуализирован и зарегистрирован на 1, 3, 5 и 7 дни.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g004

Рис. 5. Размер и округлость сфероида со временем меняются.

Изменения размера (A) и округлости (B) измеряли в сердечных сфероидах, состоящих из указанных смесей клеток, в течение 9 дней. Размер всех сердечных сфероидов измеряли на 7-й день перед их использованием для изготовления сердечных конструкций (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g005

3.2. Сократительная активность сфероидов сердца

После 10 дней культивирования сердечные сфероиды регистрировали индивидуально и анализировали с помощью программного обеспечения, разработанного собственными силами.Сфероиды были приготовлены с использованием различного процентного содержания iCell (100%, 70%, 60% и 50%). Оценивали сокращение и частоту сердечных сокращений. Интересно, что количество кардиомиоцитов в сфероидах оказалось коррелированным с более широкой амплитудой биений (рис. 6).

3.3. Гистологический анализ сердечных сфероидов

Образование сфероидов и пространственное распределение клеток внутри сфероидов, проанализированные гистологически с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (рис. 7). Все сердечные сфероиды поддерживались при высокой плотности клеток.Примечательно, что хотя экспрессия тропонина Т в сфероидах, изготовленных из смеси 80:10:10 iCells / HUVECs / NHDFs, наблюдалась на внешнем ободе (рис. 7B), сфероиды, сформированные из смеси 50:25:25, имели более обобщенные и однородные паттерн экспрессии (фиг. 7E). Последний также создавал агрегацию эндотелиальных клеток, визуализированную по экспрессии CD31, не наблюдаемую для других соотношений клеток (фиг. 7B и 7D). Кроме того, окрашенные TUNEL клетки редко встречались в сфероидах, образованных из смеси 50:25:25 (рис. 7E).

Рис. 7. Гистологический и иммуногистохимический анализ пяти типов сердечных сфероидов.

Сердечные сфероиды, содержащие различное процентное содержание iCell, HUVEC и NHDF, фиксировали и окрашивали через 7 дней. Тропонин Т является маркером для iCell, а CD31 и CD90 - маркерами для HUVEC и NHDF соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g007

3,4. Изготовление сердечных конструкций на био-3D-принтере

Сердечные сфероиды, изготовленные из смеси iCells, HUVEC и NHDF в соотношении 50:25:25, были выделены после 7 дней культивирования и использованы для изготовления сердечных конструкций с помощью принтера Bio-3D (рис. 8A и 8B).Кардиальные конструкции культивировали на наборах игл в течение дополнительных 7 дней (фиг. 8C и 8D). Через 1 день слияние и сжатие сфероидов наблюдали под микроскопом, все еще находясь на матрице игл (S1 Movie). После удаления из набора игл на 7 день после печати конструкции культивировали на пластиковых катетерах в течение еще 7 дней (фиг. 9A). Затем мы ежедневно контролировали конструкции и подтвердили, что их площадь постепенно уменьшалась с течением времени, пока не достигла примерно 70% по сравнению с их размером сразу после удаления из набора игл (рис. 9E).Примечательно, что площадь конструкций достигла 60% от их первоначального размера на 6 день (фиг. 9C и 9E).

Рис. 8. Культивирование трубчатых сердечных конструкций на игле.

Типичные изображения изготовленных трубчатых сердечных конструкций сразу после печати (A, B) и после культивирования на массиве игл в течение 7 дней (C, D).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g008

Рис. 9. Культивирование и созревание трубчатых сердечных конструкций на пластиковых катетерах.

Типичные изображения трубчатых конструкций сразу (A), через 1 день (B) и через 6 дней (C) после удаления из набора игл, а также после удаления из пластиковых катетеров (D). Были исследованы участки трубчатой ​​конструкции (E).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g009

3,5. Электростимуляция

Для изменения электрических свойств сердечных тканей в изготовленных конструкциях применялась электрическая стимуляция, вызывающая биение и сокращение.Перед стимуляцией было записано 7 ударов за 10 секунд (рис. 10С). Во время электростимуляции частота сердечных сокращений увеличивалась до 20 ударов в 10 секунд. Это выделено в S2 Movie. После прекращения стимуляции частота сердечных сокращений в сердечных конструкциях временно снизилась до 2 ударов в 10 секунд, прежде чем вернуться к исходной частоте.

Рис. 10. Анализ изменений частоты сердечных сокращений в ответ на электрическую стимуляцию трубчатых сердечных конструкций.

Трубчатые сердечные конструкции были удалены из набора игл (A) и культивированы в течение 7 дней (B).Затем была применена электрическая стимуляция, и ее эффекты были измерены и проанализированы (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g010

3,6. Гистологическое исследование сердечных сфероидов и конструкций

Сердечные сфероиды и конструкции фиксировали через 21 день после образования сфероидов, заливали парафином, делали срезы и окрашивали для иммуногистохимического анализа. Окрашивание гематоксилином и эозином выявило различия в общей структуре сфероидов и конструкций, а также в распределении ядер (рис. 11).Внутренняя область сердечной конструкции имела низкую плотность клеток по сравнению с внешней областью, и наблюдалось слияние сфероидов. Экспрессия тропонина Т, маркера iCells, наблюдалась на внешней поверхности конструкций, тогда как экспрессия CD31, маркера эндотелия, в основном присутствовала во внутренней области. Экспрессия CD31 также указывает на образование в конструкции, подобное микрососудистому. Напротив, экспрессия CD90, маркера фибробластов, оказалась повсеместной. Небольшое количество положительных ядер, указывающих на апоптотические клетки, было обнаружено во внутренней области сердечной конструкции.

Рис. 11. Иммуногистохимический анализ сердечных конструкций.

Показаны репрезентативные изображения сфероидов и трубчатых конструкций, изготовленных с помощью iCell, HUVEC и NHDF в течение 21 дня. Эти образцы наблюдались при малом (4-кратном) и большом (20-кратном) увеличении. iCell идентифицировали с помощью окрашивания тропонином T, тогда как HUVEC и NHDF окрашивали CD31 и CD90 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209162.g011

4.Обсуждение

Последние достижения в тканевой инженерии значительно улучшили методы трансплантации, используемые для различных систем органов, включая сердце. Конструкции без каркаса являются предпочтительным типом, поскольку они устраняют проблемы с иммуногенностью, связанной с каркасом. Наша группа недавно разработала био-3D-принтер, который можно использовать для изготовления различных типов тканей, таких как ткань печени и кровеносные сосуды [27,28]. В настоящем исследовании мы разработали метод производства трубчатых сердечных конструкций без каркаса, которые будут использоваться в качестве функциональных сердечных насосов в клинических применениях.

Во-первых, необходимо было оптимизировать условия сборки сердечного сфероида. С этой целью мы проанализировали различные параметры, включая размер сфероидов, округлость, время культивирования, общее количество клеток и состав / соотношение клеток, чтобы получить наиболее оптимальные сфероиды для печати конструкции. Beauchamp et al [29] ранее сообщали, что iCells обладают способностью формировать биение трехмерных клеточных агрегатов. Кроме того, Stevens et al [30] и другие [21,27] продемонстрировали, что агрегированные участки сердца, состоящие из кардиомиоцитов, производных человеческих эмбриональных стволовых клеток (ESC), эндотелиальных клеток и фибробластов, развивают сосудистые структуры, которые имеют решающее значение для в организме человека. vivo успешная трансплантация.Наше предыдущее исследование также показало, что добавление фибробластов способствует быстрой самоорганизации клеток в сфероиды и слияние сфероидов друг с другом на множестве игл [21, 27]. Таким образом, мы использовали комбинацию iCell, эндотелиальных клеток и фибробластов для формирования желаемых сердечных сфероидов. Состав смеси 50:25:25 iCells / HUVECs / NHDFs показал наиболее оптимальные результаты в отношении жизнеспособности сфероидов, сердечных функций, кинетики образования сфероидов, а также агрегации эндотелиальных клеток по сравнению с другими смесями клеток.Хотя количество кардиомиоцитов в сердечных сфероидах было прямо пропорционально их частоте сердечных сокращений, что означает, что состав смеси клеток 100: 0: 0 показал наиболее синхронное сокращение, образование сфероидов и последующее созревание конструкции были невозможны. Кроме того, поскольку Ong и др. продемонстрировали, что жизнеспособность клеток в отпечатанных сердечных пластырях была выше 90% с помощью окрашивания TUNEL и оптического электрического картирования [22], мы подтвердили жизнеспособность клеток с помощью того же анализа на наших сердечных сфероидах.Хотя мертвые клетки в сфероидах, изготовленных из смеси iCells / HUVEC / NHDF в соотношении 80:10:10 и 70:20:10, наблюдались во внутренних частях, в условиях смеси 60:20:20 и 50:25:25 было трудно обнаружить . Из-за наивысшей жизнеспособности и потенциала функциональности и стабилизированной целостности для созревания на массиве игл, сфероиды из смеси 50:25:25 iCells / HUVECs / NHDFs были использованы для дальнейшего изготовления конструкции.

Для изготовления сердечных конструкций мы использовали принтер Bio-3D.В этой системе формой конструкции можно управлять во время ее загрузки и культивирования на массиве игл. Однако после извлечения из набора игл и культивирования на пластиковом катетере конструкции начали сжиматься, и его толщина увеличивалась. Одной из важных характеристик конструкций является то, что они должны сохранять свою форму до клинического применения. Это сложно не только в нашей системе, но и в других системах, использующих структуру гидрогеля, если не используются якоря [31, 32]. В нашей системе метод культивирования после удаления из набора игл может нуждаться в улучшении.Наблюдаемое увеличение толщины конструкции может вызывать изменения в снабжении кислородом и питательными веществами после некроза клеток [33]. Во-вторых, хотя присутствие фибробластов в сфероидах способствует слиянию сфероидов на множестве игл за счет выработки коллагена внутри конструкций. С другой стороны, кажется возможным, что пролиферирующие фибробласты внутри сфероида и трубчатой ​​конструкции во время культивирования in vitro могут вызывать фиброз. В будущей работе может потребоваться регулирование и контроль пролиферации фибробластов в трубчатых сердечных конструкциях.Хотя эти методы могут быть усовершенствованы в будущих исследованиях, наши конструкции по-прежнему превосходят большинство других трехмерных сердечных конструкций без каркаса.

Также был проведен гистологический анализ сердечных сфероидов в трубчатых конструкциях после 21 дня культивирования, чтобы лучше понять, как состав конструкций может влиять на функцию. Во время культивирования наблюдали перестройку кардиомиоцитов в конструкциях. Тропонин Т, маркер iCells, расположен на внешней поверхности сердечных конструкций, тогда как у 7-дневных сфероидов его распределение оказалось повсеместным.Uchida et al. сообщили, что белок ворсин в органоидах кишечника человека из плюрипотентных стволовых клеток расположен на апикальной поверхности эпителия in vitro [34]. Хотя органы получают питание и кислород из кровеносных сосудов in vivo , изготовлены трехмерные органоиды и конструкции, контактирующие с питанием и кислородом с их поверхности. Мы предполагаем, что кардиомиоциты расположены на внешней поверхности конструкции из-за большой потребности в питании и кислороде.

Действительно, экспрессия CD31, которая идентифицирует HUVECs, была локализована во внутренней области трубчатых сердечных конструкций. Микрососудистые образования наблюдались в различных регионах, что подтверждает наши предыдущие наблюдения. Клеточная реорганизация в трубчатой ​​конструкции аналогична феномену, наблюдаемому для эндотелиальных клеток, фибробластов и гладкомышечных клеток в конструкциях, имплантированных голым крысам [27]. Эта реорганизация вряд ли отрицательно повлияет на функцию конструкции и может быть даже необходима для полного принятия сконструированной ткани хозяином.

Чтобы проверить способность наших трубчатых сердечных конструкций участвовать в активном сокращении, была применена электрическая стимуляция. В состоянии покоя частота сердечных сокращений человеческого сердца колеблется от 60 до 70 ударов в минуту [35]. Частота сердечных сокращений в наших конструкциях была ниже, всего 7 ударов за 10 секунд (рассчитано примерно 42 удара в минуту). Однако, когда электрическая стимуляция была временно применена к трубчатым сердечным конструкциям, частота сердечных сокращений увеличилась до 20 ударов в 10 секунд (экстраполировано до 120 ударов в минуту).Эти результаты подтверждаются предыдущим исследованием, показывающим, что частота сердечных сокращений в сердечных конструкциях на основе каркасов также увеличивалась после применения электростимуляции в течение 2 недель [36]. Таким образом, наши сердечные конструкции, по-видимому, могут контролировать частоту сердечных сокращений и сокращение тканей в клинических применениях.

Важно отметить, что мы не первые, кто разрабатывает функциональные трехмерные конструкции сердца для клинического применения. Онг и др. [22] также использовали принтер Bio-3D для изготовления кардиальных пластырей без каркасов, которые впоследствии были имплантированы в сердца голых крыс.Их результаты показывают, что имплантация пластыря способствовала васкуляризации и приживлению in vivo . Конечная цель этих сердечных пластырей - улучшить работу сердца и регенерацию тканей миокарда после травмы. Однако эти сердечные пластыри имеют несколько заметных ограничений, таких как низкая скорость проведения и слабые механические свойства, которые в значительной степени связаны с краткосрочным культивированием после печати. Чтобы преодолеть эти проблемы в настоящем исследовании, трубчатые сердечные конструкции культивировали на трубчатых наборах игл в биореакторе в течение 7 дней, а также в течение 7 дней после удаления из набора игл.Этот протокол культивирования, по-видимому, способствует производству внеклеточного матрикса и слиянию сфероидов. Наши конструкции могут иметь потенциал для увеличения прочности за счет использования биореактора. Очень важно поддерживать сердечную функцию и жизнеспособность клеток внутри толстой сердечной конструкции. Хотя мертвые клетки в сфероидах, изготовленных из смеси iCells / HUVEC / NHDF в соотношении 50:25:25, через 7 дней почти не наблюдались, клетки во внутренних частях конструкций сердечных канальцев после 21 дня культивирования были подтверждены.Однако положительный сигнал окрашивания TUNEL в сердечной конструкции был слабее по сравнению с таковым в сердечных сфероидах. Эти данные показывают, что организация сфероидов с помощью принтера Bio-3D может улучшить жизнеспособность клеток внутри сфероидов. И мы сообщили, что печеночные конструкции, заранее разработанные и напечатанные с микроканальной структурой для улучшения перфузии среды во время процесса созревания, улучшили жизнеспособность клеток и продукцию альбумина за счет подачи среды в конструкцию [28].Этот результат показал, что поступление питательных веществ и кислорода важно для создания трехмерной ткани. Ожидается, что в нашей будущей работе наша сердечная конструкция, предварительно разработанная и напечатанная с микроканалами, улучшит жизнеспособность клеток внутри толстых сердечных конструкций.

Наши конструкции также превосходят клеточные листы. Sekine и др. [19] сообщили о методе изготовления и трансплантации пульсирующих миокардиальных трубок, изготовленных с использованием клеточных пластин. Эти подготовленные сердечные листы обертывали вокруг ткани грудной аорты крысы in vitro и имплантировали в брюшную аорту крысы.Хотя имплантированные ими сердечные трубки были способны производить независимое сердечное давление, помимо ударов сердца хозяина, для их использования требуется донорская ткань грудной аорты. Таким образом, Seta и др. сообщили, что ткани сердечных канальцев могут подвергаться ишемическому состоянию в течение некоторого времени после трансплантации, поскольку микрососудистых образований в тканях сердечных канальцев недостаточно. Изготовленные нами конструкции можно имплантировать непосредственно в брюшную аорту, снижая зависимость от донорских тканей.

Потенциальные применения наших конструкций сердечных канальцев без каркаса многочисленны и включают как клинические (например, трансплантацию), так и in vitro (например, испытания лекарств) приложения. Фактически, несколько исследовательских групп использовали сердечные конструкции и однослойные сердечные культуры in vitro для исследования лекарственной чувствительности [29,37]. Beauchamp и др. [29], например, оценили кардиотоксичность путем тестирования различных лекарств на сфероидах iCell in vitro , используя наблюдаемые сократительные изменения сфероидов, чтобы эффективно представить токсичность кардиомиоцитов.Трубчатые сердечные конструкции, изготовленные в настоящем исследовании с использованием сфероидов iCell, аналогичным образом могут быть использованы для оценки изменений сократимости и цитотоксичности, вызванных лекарственными средствами. Несмотря на то, что необходимы дополнительные исследования, чтобы установить их полный потенциал, наши трубчатые сердечные конструкции можно использовать несколькими способами, чтобы улучшить наше понимание сердечной функции и трансплантации.

В заключение, мы изготовили сердечные трубчатые конструкции без каркасов с помощью био-3D-принтера, которые в нашем предварительном исследовании оказались полностью функциональными без добавления донорской ткани.Примечательно, что наблюдались сокращение, слияние сфероидов и клеточная реорганизация, все из которых происходят аналогично донорским тканям. Будущие исследования с использованием этих конструкций будут сосредоточены на функциях и приложениях in vitro, (например, транспорт кальция и лекарственный ответ) и in vivo, (например, сократительная сила и биосовместимость). Насколько нам известно, это первый случай, когда сердечные трубчатые конструкции были изготовлены с использованием этой технологии био-3D-печати и впоследствии протестированы для их использования в качестве сердечных насосов.В этом исследовании рассматриваются основные проблемы трансплантации органов, которые связаны с ограниченным поступлением донорских тканей, а также с иммунным отторжением трансплантата. Они преодолеваются за счет устранения необходимости в донорской ткани и ограничения количества инородного материала в конструкции (например, каркаса, биобумаги и т. Д.), Которые могут вызвать иммунный ответ у хозяина. Мы предлагаем новый оптимизированный протокол для изготовления сердечных конструкций, который можно использовать для подготовки тканей как для тестирования лекарств, так и для клинического применения.

Ссылки

  1. 1. Редфилд ММ. Сердечная недостаточность - эпидемия неопределенных масштабов N . Англ. . Дж . Мед . 2002; 347 1442–4 pmid: 12409548
  2. 2. Соуза М., Монохан Г., Раджагопалан Н., Григорян А., Гуглин М. Трансплантация сердца при сердечном амилоидозе Сердечная недостаточность . Ред. . 2017; 22 317–27 pmid: 28281017
  3. 3. Стюарт GC, Mayer JE Jr. Трансплантация сердца у взрослых с врожденным пороком сердца. Сердечная недостаточность . Клин . 2014; 10 207–18 pmid: 24275305
  4. 4. Stehlik J, Edwards LB, Kucheryavaya AY, Benden C, Christie JD, Dipchand AI et al. Реестр Международного общества трансплантации сердца и легких: 29-й официальный отчет о трансплантации сердца взрослым - 2012 J . Пересадка сердца и легких . 2012; 31 1052–64 pmid: 22975095
  5. 5. Миллер Л.В., Гуглин М., Роджерс Дж. Стоимость желудочковых вспомогательных устройств: можем ли мы позволить себе прогресс? Обращение 2013; 127 743–8 pmid: 23401115
  6. 6.Кадакия С., Мур Р., Амбур В., Тойода Ю. Текущее состояние имплантируемого LVAD Gen . Грудной . Кардиоваск . Surg . 2016; 64 501–8 pmid: 27270581
  7. 7. Лангер Р., Ваканти Дж. Достижения в тканевой инженерии J . Педиатр . Surg . 2016; 51 с 8 до 12 часов, ид .: 26711689
  8. 8. Такахаши К., Танабе К., Охнуки М., Нарита М., Ичисака Т., Томода К. и др. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами Cell .2007; 131 861–72 pmid: 18035408
  9. 9. Окита К., Яманака С. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: возможности и проблемы Philos . Транс . R . Соц . Лондон . В . Биол . Sci . 2011; 366 2198–207 pmid: 21727125
  10. 10. Тран TH, Ван X, Браун C, Чжан Y, Schinke M, Izumo S и др. Wnt3a-индуцированное образование мезодермы и кардиомиогенез в эмбриональных стволовых клетках человека Стволовые клетки .2009; 27 1869–78 pmid: 19544447
  11. 11. Каттман С.Дж., Витти А.Д., Гальярди М., Дюбуа Н.С., Ниапур М., Хотта А. и др. Стадийно-специфическая оптимизация передачи сигналов activin / nodal и BMP способствует сердечной дифференцировке линий плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека Cell Stem Cell 2011; 8 228-40 pmid: 21295278
  12. 12. Тохьяма С., Хаттори Ф., Сано М., Хишики Т., Нагахата Ю., Мацуура Т. и др. Четкий метаболический поток позволяет проводить крупномасштабную очистку кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека Cell Stem Cell .2013; 12 127–37 pmid: 23168164
  13. 13. Годье-Фурнемон А.Ф., Тибурси М., Вагнер Э., Девентер М., Ляммле С., Эль-Армуш А. и др. Физиологическая частотно-силовая характеристика сконструированной сердечной мышцы при электромеханической стимуляции. Биоматериалы 2015; 60 82–91 pmid: 25985155
  14. 14. Tandon N, Taubman A, Cimetta E, Saccenti L, Vunjak-Novakovic G. Портативный биореактор для перфузии и электростимуляции сконструированной сердечной ткани Conf . Proc . IEEE Eng . Мед . Биол . Соц . 2013 6219–23 pmid: 24111161
  15. 15. Джавад Х., Лион АР, Хардинг С.Е., Али Н.Н., Боккаччини АР. Тканевая инженерия миокарда. Br . Мед . Бык . 2008; 87 31–47 PMID: 187
  16. 16. Сакагути К., Симидзу Т., Окано Т. Построение трехмерной васкуляризованной сердечной ткани с помощью инженерии клеточного листа J . Контроль . Выпуск . 2015; 205 83–8 pmid: 25523520
  17. 17. Кикучи Т., Симидзу Т., Вада М., Ямато М., Окано Т. Автоматическое изготовление трехмерных тканей с использованием техники манипулятора клеточного листа Биоматериалы 2014; 35 2428–35 pmid: 24370007
  18. 18. Сава Ю., Миягава С., Сакагути Т., Фудзита Т., Мацуяма А., Сайто А. и др. Тканево-инженерные листы миобластов улучшили сердечную функцию в достаточной степени, чтобы прекратить LVAS у пациента с DCM: отчет о случае Surg . Сегодня . 2012; 42 181–4 pmid: 22200756
  19. 19. Секин Х., Симидзу Т., Хобо К., Секия С., Ян Дж., Ямато М. и др. Совместное культивирование эндотелиальных клеток в тканях кардиомиоцитов усиливает неоваскуляризацию и улучшает сердечную функцию ишемизированного сердца. Тираж. 30 сентября 2008 г .; 118 (14 доп.): S145–52 pmid: 18824746
  20. 20. Jakab K, Norotte C, Damon B, Marga F, Neagu A, Besch-Williford CL и др. Тканевая инженерия путем самосборки клеток, напечатанных в топологически определенные структуры Tissue Eng . Часть A 2008; 14 413–21 pmid: 18333793
  21. 21. Ногучи Р., Накаяма К., Ито М., Камохара К., Фурукава К., Ояма Дж. И др. Разработка трехмерной преваскуляризованной сократительной сердечной пластыря без каркаса для лечения сердечных заболеваний J . Пересадка сердца и легких . 2016; 35 137–45 pmid: 26433566
  22. 22. Онг С.С., Фукуниши Т., Чжан Х., Хуанг С.Й., Нашед А., Блазески А. и др. Трехмерная биопечать сердечной ткани без биоматериалов с использованием индуцированных человеком кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток Sci . Репутация . 2017; 7 4566 pmid: 28676704
  23. 23. Sekine H, Shimizu T, Yang J, Kobayashi E, Okano T. Пульсирующие миокардиальные трубки, изготовленные с помощью инженерии клеточного листа Circulation 2006; 114 I87–93 pmid: 16820651
  24. 24. Seta H, Matsuura K, Sekine H, Yamazaki K, Shimizu T. Трубчатые сердечные ткани, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, генерируют импульсное давление in vivo. Научный доклад 30 марта 2017 г .; 7: 45499. pmid: 28358136
  25. 25.Гримм Ф.А., Ивата Ю., Сиренко О., Биттнер М., Русин И. Мультиплексирование анализа с высоким содержанием для скрининга токсичности в кардиомиоцитах и ​​гепатоцитах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, Assay Drug Dev. Технол . 2015; 13 529–46
  26. 26. Каттман С.Дж., Кунсе СН, Суонсон Б.Дж., Энсон Б.Д. Стволовые клетки и их производные: возрождение сердечно-сосудистых трансляционных исследований J . Кардиоваск . Перевод . Рез. . 2011; 4 66–72 pmid: 21061105
  27. 27.Ито М., Накаяма К., Ногучи Р., Камохара К., Фурукава К., Учихаши К. и др. Трубчатые ткани без каркаса, созданные с помощью принтера Bio-3D, подвергаются ремоделированию и эндотелиализации при имплантации в аорту крысы PLoS One . 2015; 10 e0136681 pmid: 26325298
  28. 28. Янаги Ю., Накаяма К., Тагучи Т., Эносава С., Тамура Т., Ёсимару К. и др. Способы выращивания зачатка печени in vivo и ex vivo через тканевое соединение Sci . Репутация . 2017; 7 14085 pmid: 299
  29. 29.Бошамп П., Мориц В., Кельм Дж. М., Ульрих Н. Д., Агаркова И., Ансон Б. и др. Разработка и характеристика трехмерной сфероидной модели без каркаса индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов человека Tissue Eng . Часть C Методы 2015; 21 852–61 pmid: 25654582
  30. 30. Стивенс KR, Kreutziger KL, Dupras SK, Korte FS, Regnier M, Muskheli V и др. Физиологическая функция и трансплантация свободной от каркаса и васкуляризированной ткани сердечной мышцы человека Proc . Нац. . Акад. . Sci . У С А . 2009; 106 16568–73 pmid: 19805339
  31. 31. ван Марион М.Х., Бакс Н.А., ван Турнхаут М.С., Мауретти А., ван дер Шафт Д.В., Гуманс М.Дж. и др. Поведение CMPC в однонаправленных ограниченных и свободных от напряжений трехмерных гидрогелях J . Мол . Ячейка . Кардиол . 2015; 87 79–91 pmid: 26278995
  32. 32. Стоппель WL, Каплан DL, Черный LD 3-й. Электрическая и механическая стимуляция сердечных клеток и тканевых конструкций Adv . Доставка лекарств . Ред. . 2016; 96 135–55 pmid: 26232525
  33. 33. Эммерт М.Ю., Хичкок Р.В., Хёрструп С.П. Клеточная терапия, системы трехмерного культивирования и тканевая инженерия для регенерации сердца Adv . Доставка лекарств . Ред. . 2014; 69–70 254–69 pmid: 24378579
  34. 34. Учида Х, Мачида М, Миура Т, Кавасаки Т, Окадзаки Т, Сасаки К. и др. Система, не содержащая ксеногенов, генерирует функциональные органоиды кишечника человека из плюрипотентных стволовых клеток, JCI Insight .2017, 12; 2 (1): e86492. pmid: 28097227
  35. 35. Mason JW, Ramseth DJ, Chanter DO, Moon TE, Goodman DB, Mendzelevski B. Электрокардиографические эталонные диапазоны получены для 79 743 амбулаторных пациентов J . Электрокардиол . 2007; 40 228–34 pmid: 17276451
  36. 36. Radisic M, Park H, Shing H, Consi T, Schoen FJ, Langer R и др. Функциональная сборка сконструированного миокарда путем электростимуляции сердечных миоцитов, культивируемых на каркасах Proc . Нац. . Акад. . Sci . У С А . 2004; 101 18129–34 pmid: 15604141
  37. 37. Амано Ю., Нисигучи А., Мацусаки М., Исеока Х., Миягава С., Сава Ю. и др. Разработка васкуляризированных тканей 3D-кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, методом послойной фильтрации и их применение в фармацевтических анализах Acta Biomater . 2016; 33 110–21 п.м.д.: 26821339

Строительные леса для инженерии трубчатых тканей

Abstract

Полые органы и тканевые системы управляют различными функциями организма.Многие из этих полых или трубчатых систем, таких как сосудистая сеть, кишечник и трахея, являются общими мишенями для тканевой инженерии, учитывая их значимость для многих заболеваний и функций организма. По мере развития области тканевой инженерии были созданы многочисленные настольные модели в качестве платформ для фундаментальной науки и тестирования лекарств. Производство трубчатых каркасов для различных приложений тканевой инженерии обладает многими общими чертами, такими как необходимость создания неповрежденного канальцевого отверстия и образования полупроницаемого эпителия или эндотелия.Таким образом, область сошлась на серии производственных технологий для производства этих структур. В этом обзоре мы обсуждаем некоторые из наиболее распространенных применений тканевой инженерии в контексте трубчатых тканей и методы, с помощью которых эти структуры могут быть созданы. Мы предлагаем обзор общей структуры и анатомии этих тканевых систем, а также ряд общих критериев проектирования трубчатой ​​тканевой инженерии. Мы разделяем методы производства трубчатых лесов на следующие категории: литье, электропрядение, прокатка, 3D-печать и децеллюляризация.Мы обсуждаем современные модели в контексте тканевой инженерии сосудов, кишечника и трахеи. В заключение мы обсудим будущее этих областей.

Ключевые слова: биоматериалов, 3D-печать, электроспиннинг, децеллюляризация, просвет, сосуды, кишечник, трахея

Введение

Функция человеческого тела зависит от трубчатых тканей и тканевых структур. Эти ткани, включая сосудистую сеть, кишечник, трахею и многие другие, выполняют различные функции в организме, начиная от поглощения питательных веществ и заканчивая транспортировкой кислорода.Как и следовало ожидать, учитывая широкий набор функций, связанных с трубчатыми тканями, эти структуры подвержены множеству заболеваний и травм. Таким образом, значительное внимание было уделено созданию моделей трубчатых систем для исследований болезней, фундаментальной науки и открытия / эффективности лекарств. Многие из этих моделей используют принципы тканевой инженерии для воссоздания функции этих систем на столе, не требуя использования моделей на животных (Bitar and Raghavan, 2012; Seifu et al., 2013; Law et al., 2016). Методы, используемые для производства этих тканевых инженерных систем, играют важную роль в их конечной функции. Здесь мы рассмотрим конструкцию тканевых инженерных систем для создания трубчатых моделей.

Трубчатые ткани обладают многими объединяющими структурными характеристиками, несмотря на их различные функции. Как правило, эти ткани имеют ламеллярную структуру с последовательными слоями ткани, окружающими внутреннее отверстие. Это отверстие, называемое просветом, является местом транспортировки и удержания определенной среды для конкретной трубчатой ​​ткани.Этот просвет выстлан множеством барьерных клеток, называемых эпителием (или эндотелием в случае сосудистой сети). Эта структура предназначена для отделения внутреннего содержимого просвета от окружающих тканей и органов, обеспечивая при этом избирательное проникновение и транспортировку через эпителий. Эпителий расположен на ложе внеклеточного матрикса (ЕСМ), который обеспечивает структурную поддержку просвета и эпителия (Hendow et al., 2016). Этот слой ECM может присутствовать в различных формах, но обычно он состоит из клеток, встроенных в соединительную ткань, включая различные белки, такие как коллаген, эластин и т. Д.В зависимости от функции конкретной ткани могут также присутствовать другие тканевые слои. Например, учитывая роль сосудистой сети в перемещении крови по телу, кровеносные сосуды часто содержат слой гладких мышц, который способствует расширению и сужению сосудов в сосудистой системе. Независимо от конкретной функции трубчатой ​​ткани, основное назначение этих структур включает отделение одной среды от другой, направление и транспортировку различных жидкостей, газов и твердых тел.

Тканевая инженерия - это комбинация клеток и шаблона для создания структуры, которая воспроизводит естественную функцию конкретной ткани или тканевой системы. Часто матрица представляет собой каркас или гидрогель, на котором клетки могут пролиферировать и продуцировать ECM. Здесь мы обсуждаем каркасы и гидрогели почти как синонимы, поскольку способы производства трубчатых каркасов и трубчатых гидрогелей не обязательно отличаются. Однако эти структуры обладают разными фундаментальными свойствами, и каждую из них следует рассматривать независимо для конкретного приложения.Понимания естественной функции и физиологии ткани часто бывает достаточно, чтобы информировать о выборе клеток и материалов каркаса для применения в тканевой инженерии. Однако конструкция каркаса является сложной задачей, учитывая необходимость создания поддерживающей структуры для роста клеток и создания желаемой ткани, не влияя на общую функцию полученной структуры. Эти проблемы особенно важны при проектировании трубчатых систем, учитывая необходимость создания неповрежденного просвета, который может поддерживать образование эпителия и других компонентов.Для производства строительных лесов использовались различные производственные подходы, включая литье, электропрядение, прокатку, трехмерную (3D) печать и децеллюляризацию.

Определение результирующих свойств трубчатых систем может быть затруднено, особенно из-за геометрии. Помимо изготовления трубчатого каркаса, характеристика взаимодействия между клеточными и каркасными компонентами, а также их совокупная структурная целостность является фундаментальной. Например, образование и постоянная целостность эпителиального или эндотелиального барьера обеспечивает избирательную проницаемость основных питательных веществ и побочных продуктов метаболизма, предотвращая проникновение вредных или патогенных соединений.Таким образом, без успешного формирования барьера и его характеристики функциональность и даже выживаемость этих моделей были бы ограничены. Точно так же любые исследования транспорта лекарств будут признаны недействительными, если формирование барьера будет недостаточным. Межклеточные соединения обеспечивают эту барьерную функцию и состоят из различных белков, таких как кадгерины, зонулин-1 (ZO-1) и т. Д. Как правило, мембраны, подобные кишечному эпителию, обладают плотными контактами, которые в высокой степени регулируют прохождение ионов / молекул через эпителий, тогда как эндотелий сосудов, например, более проницаем.

В этом обзоре мы обсуждаем методы, обычно используемые для создания тканевых каркасов для трубчатых систем. Наша цель - дать категоризацию доступных методологий производства каркасов, чтобы помочь тканевым инженерам ориентироваться в этой обширной области. Таким образом, мы решили сосредоточиться на трех конкретных тканевых системах, которые представляют различные проблемы дизайна в этой области: сосудистая сеть, кишечник и трахея для повторения функций многих систем трубчатых тканей, присутствующих в организме.Сначала мы обсудим анатомию этих систем и некоторые общие критерии для конструкции трубчатых каркасов. Затем мы классифицируем доступные технологии изготовления строительных лесов. Мы переходим к рассмотрению некоторых применений этих методов для выбранных нами тканевых систем. Наконец, мы завершаем обсуждение будущего дизайна каркасов тканевой инженерии для систем трубчатых тканей.

Структура собственных трубчатых тканей

В организме присутствуют различные трубчатые ткани, включая сосудистую систему, пищеварительную систему, дыхательную систему, лимфатическую систему, репродуктивную систему и многие другие.Как обсуждалось выше, мы решили выделить сосудистую сеть, кишечник и трахею, поскольку эти приложения являются одними из наиболее широко исследованных с точки зрения создания инженерных моделей трубчатой ​​ткани (Bitar and Raghavan, 2012; Seifu et al., 2013; Hendow et al., 2016; Law et al., 2016). Кроме того, эти системы обладают различными функциями, которые отличают их друг от друга с точки зрения дизайна. Ниже мы обсудим особенности строения и физиологии каждой из этих систем.

Сосудистая структура

Основная роль сосудистой системы заключается в транспортировке крови по всему телу с относительно высокими скоростями (Riva et al., 1985; Klarhöfer et al., 2001), создавая значительное напряжение сдвига жидкости на стенках кровеносный сосуд (Akintewe et al., 2017). Кроме того, эндотелий сосудов относительно проницаем, что позволяет транспортировать биохимические факторы через стенку сосудов и даже клетки во время некоторых болезненных состояний (Park-Windhol and D’Amore, 2016).Кровеносные сосуды различаются по размеру от капилляров и микрососудов, диаметр которых составляет всего микрон (Sieminski and Gooch, 2000), до более крупных вен и артерий, диаметр которых может составлять около 30 мм в случае легочной артерии (Kuriyama et al., 1984). Маленькие капилляры, такие как те, которые составляют гематоэнцефалический барьер, могут состоять только из одной клетки, намотанной на себя, чтобы создать внутренний просвет (Abbott et al., 2006). Однако мы сосредоточимся на более крупных кровеносных сосудах, которые имеют пластинчатую структуру, разделенную на три слоя (): внутренняя оболочка, средняя оболочка и адвентициальная оболочка.Как правило, интима содержит эндотелий, среда состоит из слоя гладких мышц, а адвентиция состоит из слоя соединительной ткани (James and Allen, 2018). Эндотелиальный слой клеток составляет стенку сосудов. Эти клетки образуют полупроницаемую мембрану, которая позволяет транспортировать питательные вещества, насыщать кислородом и удалять отходы из окружающих тканей (Park-Windhol and D’Amore, 2016). Слой гладких мышц в средней оболочке помогает контролировать расширение сосудов, что может регулировать местный кровоток.Наконец, адвентициальная оболочка обеспечивает поддержку внутренних слоев в дополнение к размещению множества нервов, иммунных клеток и других систем поддержки сосудистой сети (Джеймс и Аллен, 2018). Сердце перекачивает кровь через просвет этих сосудов. Эта накачка создает относительно высокие скорости потока жидкости, ~ 30 мл / мин (Klarhöfer et al., 2001), тем самым вызывая значительный сдвиг жидкости на стенках сосудистой сети, что является дополнительным необходимым фактором в любой модели тканевой инженерии.

(A) Структура систем нативных трубчатых тканей. В частности, эта схема подчеркивает структуру сосудистой сети, кишечника и трахеи. (B) Типичная структура трубчатых систем тканевой инженерии, соответствующая родным системам в (A) .

Структура кишечника

Кишечник - это часть желудочно-кишечного тракта, которая простирается от рта через пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник и, наконец, в прямую кишку и задний проход.Основная функция кишечника - поглощать питательные вещества из пищи и жидкостей, которые мы принимаем, и выводить оставшиеся отходы из организма, при этом каждая часть желудочно-кишечного тракта состоит из четырех слоев. Начиная с внутренней выстилки просвета, этими слоями являются слизистая, подслизистая, собственная мышечная оболочка и серозная оболочка (). В этом обзоре мы фокусируемся на кишечнике и описываем слои в контексте этих органов в сравнении с другими частями желудочно-кишечного тракта. Слизистая оболочка содержит эпителий кишечника и выполняет абсорбционную, секреторную и защитную функции.Кишечный эпителий представляет собой плотную барьерную систему, надежно отделяющую внутреннее содержимое просвета от окружающей ткани (Suzuki, 2013). Кишечная эпителиальная ткань имеет сложную трехмерную структуру, состоящую из проекций просвета, называемых ворсинками, с промежуточными инвагинациями, называемыми криптами (Santos et al., 2018). Эта трехмерная архитектура максимизирует площадь внутренней поверхности, способствуя адсорбции питательных веществ (Rao and Wang, 2010). Кишечный эпителий состоит из множества типов клеток с различными функциями, которые имеют полурегулируемое распределение вдоль этой трехмерной структуры.Как правило, эти клетки и их соответствующие функции заключаются в следующем: энтероциты - абсорбция питательных веществ и формирование кишечного барьера; бокаловидные клетки - секреция муцина; энтероэндокринные клетки - чувствительность к питательным веществам и микробам и связь с кишечной нервной системой; транзитные амплифицирующие клетки - дифференцировка в сторону секреторных или абсорбционных ветвей; а также клетки пучка, клетки Панета, стволовые клетки кишечника и другие (Santos et al., 2018). Эти эпителиальные клетки прикреплены к собственной пластинке, слою соединительной ткани, который окружен слоем гладкомышечных клеток.Следующий слой - это подслизистая основа, которая содержит ряд иммунных клеток, нервов и лимфатических клеток. Этот слой окружен собственной мышечной тканью, которая обеспечивает перистальтическую перекачку через мышечные клетки, выполняя важную функцию моторики кишечника. Наконец, самым внешним слоем является серозная оболочка или, в некоторых случаях, адвентиция, в зависимости от нынешних популяций клеток, которая формирует барьер вокруг желудочно-кишечного тракта (Rao and Wang, 2010). Кишечник также обладает сложной серией нервов, называемой кишечной нервной системой, которая состоит из двух параллельных нервных сплетений, подслизистого сплетения и миэнтерического сплетения, которые проходят вдоль желудочно-кишечного тракта (Furness, 2012).Наконец, внутренняя часть кишечника содержит большую группу бактерий, называемую микробиомом кишечника, которые могут влиять на различные другие органы по всему телу (Cryan et al., 2019), в дополнение к еще большему усложнению конструкции тканевой инженерии.

Структура трахеи

Трахея играет важную роль в процессах глотания, речи и дыхания. Он расположен ниже верхних дыхательных путей (носовая полость, гортань, глотка) и образует часть нижних дыхательных путей (трахея, бронхи, бронхиолы, альвеолы), его основная функция - проводить и нагревать воздух (Brand-Saberi and Schäfer, 2014).Трахея состоит из четырех основных слоев () : слизистой оболочки, подслизистой основы, гиалинового хряща и адвентиции. Слизистая оболочка содержит псевдостратифицированный эпителий, который выстилает просвет и содержит множество типов клеток, включая секреторные клубные клетки, реснитчатые клетки, слизистые бокаловидные клетки, базальные стволовые клетки и нейроэндокринные клетки легких. Ресничные, продуцирующие слизь и секреторные клетки действуют согласованно, помогая мукоцилиарному очищению и защите от инфекции, тогда как базальные клетки помогают в регенеративных процессах (Brand-Saberi and Schäfer, 2014).Подслизистая основа - это слой соединительной ткани, содержащий подслизистые железы, которые способствуют секреции слизи. Слой хряща состоит из подковообразных колец гиалинового хряща, соединенных фиброэластической тканью, которая с обратной стороны закрыта перепончатой ​​структурой, состоящей из продольно ориентированных гладких мышц. Наконец, адвентиция состоит из соединительной ткани. И хрящевой, и адвентициальный слои имеют основополагающее значение для создания уникальных структурных и механических свойств трахеи.Например, особая гибкость, которая позволяет вращать и сгибать шею, сохраняя при этом достаточную прочность конструкции, чтобы выдерживать сжатие и изменения давления во время дыхательных процессов. Чтобы отразить и интегрировать со средой in vivo , инженерные модели трахеальной ткани должны соответствовать этим механическим требованиям (Boazak and Auguste, 2018). В адвентиции также находится множество других типов клеток, таких как фибробласты, адипоциты, нервы и соединения с сосудистой сетью, которые необходимы для удовлетворения потребностей в крови, питательных веществах и метаболизме.Дыхательной системе требуется интерфейс воздух-жидкость между внутренней частью просвета и окружающим эпителием (Pezzulo et al., 2011; de Souza Carvalho et al., 2014), создавая среду, отличную от жидкой среды сосудов и кишечника. системы, которые может быть трудно изготовить в моделях тканевой инженерии. В отличие от моделей in vitro , обсуждаемых для сосудистой сети и кишечника, перспективы инженерии трахеальной ткани до сих пор в основном касаются имплантируемых каркасов для замены трахеи (Bogan et al., 2016; Law et al., 2016; Etienne et al., 2018). Действительно, трахея подвержена целому ряду заболеваний дыхательных путей, которые могут быть результатом инфекции, стеноза, коллапса или рака (Etienne et al., 2018). Развитие подходов к биомедицинской инженерии, которые воспроизводят ткань трахеи, в значительной степени было мотивировано этими приложениями. Здесь мы обсудим некоторые из этих исследований, в которых основное внимание уделяется созданию имплантатов и их дальнейшему развитию для использования в качестве настольных моделей заболеваний.

Критерии проектирования тканевой инженерии трубчатых систем

Физиология трубчатых тканей часто бывает сложной, требуя различных факторов для создания приблизительной модели желаемой ткани.Как правило, тканевые инженерные системы используют тип (или типы) клеток в сочетании с каркасом для воссоздания основной функции (или функций) ткани. Однако выбор подходящих типов клеток и архитектур каркасов может быть трудным. Здесь мы выделили некоторые из необходимых критериев проектирования, которые следует учитывать при производстве каркаса для инженерии трубчатых тканей ().

ТАБЛИЦА 1

Критерии проектирования для развития инженерных каркасов трубчатой ​​ткани в зависимости от типа ткани.

907 907 907 907 907 907
Тканевая система Клеточная
Механическая
Прочие
Смежный эпителий / эндотелий Слой слизистой оболочки Гладкая соединительная ткань 907 42 Слой слизистой оболочки 907 Повышение давления Механическая стимуляция (перистальтика) Разделение просветной камеры Интерфейс воздух-жидкость
Сосудистая система X X X
Кишечник X X X X X X X X
X 407 X 907 907 907 9028 907 907 907 907 Х X X

При проектировании строительных лесов для трубчатых систем возникает множество проблем.Во-первых, необходимо рассмотреть источник и типы клеток, при этом любая трубчатая система требует источника эпителиальных клеток. Однако точное поведение этих клеток будет варьироваться в зависимости от рассматриваемой ткани. Эпителиальные клетки часто культивируются совместно с клетками, продуцирующими ECM, такими как фибробласты или гладкомышечные клетки (Boland et al., 2004; Yoshikawa et al., 2011; Chen et al., 2015), но даже клетки, продуцирующие матрикс может отличаться в зависимости от приложения. Например, трахея требует производства хрящевого внеклеточного матрикса с использованием хондроцитов (Lin et al., 2009) или мезенхимальные стволовые клетки, дифференцированные по хондрогенным путям (Asnaghi et al., 2009; Haykal et al., 2014). Разным тканям также потребуются разные поддерживающие клетки. Например, нативный кишечный эпителий содержит бокаловидные клетки, вырабатывающие слизь (Dosh et al., 2019). И естественная сосудистая сеть, и кишечник обладают слоем мускулатуры (Boland et al., 2004), что требует поиска соответствующих мышечных клеток. Мы суммировали некоторые общие клеточные линии или первичные клетки, используемые для восстановления нативной функции в тканевых инженерных моделях ().

ТАБЛИЦА 2

Клетки, обычно используемые для тканевых инженерных моделей сосудистой сети, кишечника и трахеи.

9027 EndUmbilical EndUmbilical клетки 907 Гладкая мышца 2012; Knight et al., 2013 907 907 907 907 907 907 907 907 907 907
Тканевая система Слой нативной ткани Модель клетки Функция клетки Ссылки
Кровеносный сосуд Клетка Intima Туника Intima Клетка Intima Клетка EndUmbilical EndUmbilical человека Boland et al., 2004; Lovett et al., 2007; Du et al., 2012; Wang et al., 2014; Cui et al., 2019
Endothelial Progenitor Cell (EPC) Endothelial Cell Neff et al., 2011; Ju et al., 2017; Atchison et al., 2017
Первичная эндотелиальная клетка Эндотелиальная клетка Matsuda, 2004, 200; Опиц и др., 2004; Zang et al., 2013
Tunica Media Первичные клетки гладких мышц Клетки гладких мышц Seliktar et al., 2003; Опиц и др., 2004; Swartz et al., 2005; Ли и др., 2007; Zhang et al., 2013; Fu et al., 2014; Cui et al., 2019
Tunica Adventitia Кожные фибробласты Fibroblast Seliktar et al., 2003; Boland et al., 2004
Кишечник Слизистая оболочка Клетки Caco-2 Энтероцит Costello et al., 2014; Чен и др., 2015; Ladd et al., 2018
HT-29-MTX Cells Goblet Cell Chen et al., 2015
Подслизистая основа Первичный кишечный миофибробласт Миофибробласт Чен и др., 2015
Гладкая мышца
Сероза
Трахея Слизистая оболочка Первичная дыхательная эпителиальная клетка et al., 2017; Kreimendahl et al., 2019; Park et al., 2019
Turbinate Mesenchymal Stromal Cell Epithelial Cell Park et al., 2018; Ahn et al., 2019
Подслизистая основа
Гиалиновый хрящ Мезенхимальные стволовые клетки Стволовые клетки, полученные из жировой ткани Хондроциты Giraldo-Gomez et al., 2019
Аурикулярный хондроцит Хондроцит Park et al., 2019
Adventitia Назальный фибробласт Основным требованием для каждого трубчатого каркаса является формирование непрерывной эпителиальной или эндотелиальной выстилки (). Клетки наиболее эффективно засевают гомогенно на двумерных (2D) непористых поверхностях, таких как колбы для культивирования клеток, или в среде для инъекций, такой как гидрогели.Однако трубчатые каркасы не являются плоскими и, как правило, пористыми. Следовательно, необходимость равномерного высева на трехмерной поверхности требует альтернативных методологий. Например, исследователи высевали клетки на плоские мембраны, а затем свернули эти мембраны в пробирки (Yuan et al., 2012; Cheng et al., 2017; Zhao et al., 2018). В других исследованиях использовались динамические методы, основанные на том, что клетки гомогенно прилипают к окружающим стенкам посредством вращения или срабатывания под давлением (Niklason and Langer, 1997; Godbey et al., 2004; Nieponice et al., 2008). Пористые каркасы полезны тем, что они обеспечивают больший доступ клеток к среде, но эти поры также затрудняют образование непрерывного эпителия. В некоторых исследованиях обнаружено, что поры заполняются обратно-заполненными клетками, продуцирующими ECM, или депонирующими клетками, при послойном подходе, чтобы способствовать образованию эпителия (Liu et al., 2015; Chen et al., 2015). Многие исследования с использованием имплантатов также полагаются на инфильтрацию клеток in vivo . Все эти методы имеют ограничения, но непрерывная итерация улучшила возможность выполнения этой конкретной задачи инженерии трубчатой ​​ткани.

Еще одно важное соображение при проектировании - обеспечение питательными веществами всех клеток в системе. Тубулярные системы по своей природе содержат эпителиальные клетки, но они также могут содержать поддерживающие клетки, находящиеся под эпителием (). В случае сосудистых систем эти лежащие в основе клетки теоретически могут получать питательные вещества через эндотелиальную стенку, поскольку эндотелий сосудов по своей природе проницаем для этой цели. Однако инженерия кишечной и респираторной ткани представляет собой особую проблему, поскольку просвет не должен использоваться для обеспечения питательными веществами каких-либо клеток в системе, учитывая функцию этих тканей (Bitar and Raghavan, 2012).В организме питательные вещества доставляются тканям, лежащим под эпителием, окружающей сосудистой сетью. Чтобы имитировать естественные ткани, тканевые инженерные модели полагаются на перфузию каркаса средой для имитации транспорта питательных веществ. Однако отделение люминального отсека от окружающего каркаса затруднено. Индивидуальные биореакторы могут выполнить эту задачу (Haykal et al., 2014; Zhou et al., 2018), но конструкция и установка биореактора также усложняют культивирование для системы.

Вторичные критерии проектирования относятся к конкретной функции трубчатой ​​системы.Например, сосудистые системы часто вызывают движение жидкости, имитирующее кровоток. Таким образом, в сосудистых системах используются внешние насосы, как правило, с пульсирующим режимом откачки (Niklason and Langer, 1997; Niklason et al., 1999; Opitz et al., 2004), что также требует способности каркаса выдерживать возникающие механические силы. от перекачивания, т.е. давления и сдвига жидкости (). Также известно, что сдвиг жидкости влияет на фенотип и морфологию эндотелия сосудов (Wang et al., 2013; Wang et al., 2016a; Polacheck et al., 2017) и регулирует ангиогенез in vitro (Song and Munn, 2011; Galie et al., 2014), что может быть полезно в различных моделях тканевой инженерии. Для точной модели кишечника требуется перистальтическая помпа, чтобы имитировать перистальтику кишечника. Перистальтика достигается с помощью внешних биореакторов (Zhou et al., 2018), но биореакторы часто изготавливаются по индивидуальному заказу, что требует дальнейшего проектирования и оптимизации. Во-вторых, естественная кишечная среда содержит когорту бактерий.Проникновение бактерий в просвет тканевой инженерии возможно (Costello et al., 2014), но также еще больше усложняет условия культивирования. Другие системы, такие как трахея, требуют наличия воздуха в просвете, что может усложнить условия культивирования. Во многих исследованиях использовались биореакторы, которые вращали трубчатый каркас трахеи вдоль своей оси, при этом половина каркаса погружалась в среду, а другая половина - в воздух, чтобы создать поверхность раздела воздух-жидкость (Lin et al., 2009). Однако этот подход не идеален для биомиметических исследований, оценивающих доставку лекарств, учитывая его несходство с природной средой трахеи.

Напряжения, присутствующие при динамическом течении жидкости через трубку. (A) Прокачка жидкой или газообразной среды через трубку создает давление на стенках трубки. Наибольшее напряжение, возникающее в результате этого повышения давления, - это кольцевое напряжение (σ h ). Любые подмости должны обладать достаточной прочностью, чтобы компенсировать это напряжение обруча. (B) Движение жидкости также вызывает напряжение сдвига (τ s ) на стенках трубы. Как правило, эти коэффициенты (σ h и τ s ) могут быть рассчитаны на основе геометрии трубы, т.е.е., толщину стенки (t) и внутренний радиус (r), давление (p) на стенки трубы, расход жидкости (v) и вязкость жидкости. Однако эти расчеты усложняются пористостью каркаса и возможностью влияния роста клеток на каркас в ходе эксперимента.

Методы изготовления трубчатых каркасов

Для производства трубчатых каркасов для тканевой инженерии можно использовать различные методологии. Мы разделили эти методы на пять категорий (), чтобы помочь в разработке и планировании экспериментов.Ниже мы обсудили общие методики для каждого метода, а также рассмотрели их преимущества и ограничения. В других обзорах также рассматривались общие стратегии тканевой инженерии трубчатых систем (Bitar and Raghavan, 2012; Seifu et al., 2013; Hendow et al., 2016; Law et al., 2016; Song et al., 2018).

ТАБЛИЦА 3

Классификация методов производства трубчатых каркасов для тканевой инженерии.

Метод изготовления Преимущества Недостатки Каталожные номера
• Совместимость с большинством типов материалов
• Простота и удобство применения
• Применимо к материалам с ячейками 28–
• 907 производить сложные формы
• Обработка может привести к токсичным побочным продуктам
• Требуется метод вторичного посева клеток
Сосудистая сеть
Seliktar et al., 2003; Мацуда, 2004; Опиц и др., 2004; Swartz et al., 2005; Лю и др., 2007; Nieponice et al., 2008; Ma et al., 2010; Wang et al., 2014; Guo et al., 2017; Атчисон и др., 2017; Strobel et al., 2018b; Im et al., 2019
Intestine
Yu et al., 2012; Захем и др., 2012; Чен и др., 2015; Чжоу и др., 2018; Ladd et al., 2018, 2019; Roh et al., 2019
Trachea
Naito et al., 2011
• Высокая степень контроля свойств каркаса (пористость, механика и т. Д.)
• Легко применяется для формирования трубок
• Непосредственно совместим с белками
• Обработка может приводить к токсичным побочным продуктам
• Требуется метод вторичного посева клеток
• Оптимизация, необходимая для экспериментальной установки
Vascular
Boland et al., 2004; Ли и др., 2007; Смит и др., 2008; Wang et al., 2009; Хан и др., 2011; Du et al., 2012; Zhang et al., 2013; Fu et al., 2014; Чжоу и др., 2016; Ju et al., 2017; Strobel et al., 2018a; Родригес и др., 2019,
Кишечник,
, Юн и Ким, 2010; Knight et al., 2013
Trachea
Hinderer et al., 2012; Махони и др., 2016; Wu et al., 2017; Best et al., 2018; Канг и др., 2019; O'Leary et al., 2020
• Клетки можно засеять в 2D и свернуть в трехмерную пробирку
• Просто и легко реализовать
• При производстве может потребоваться обработка каркаса засеянного клетками
• Герметизация пробирки может быть сложно
Сосудистые
Niklason et al., 2001; Шен и др., 2003; L’Heureux et al., 2006; Pricci et al., 2009; Konig et al., 2009; Gauvin et al., 2010; Rayatpisheh et al., 2014; Юнг и др., 2015; Gui et al., 2016; Чжао и др., 2018; Wang et al., 2018
Intestine
Grikscheit et al., 2002, 2004
• Высокая степень индивидуализации и контроля над производством строительных лесов
• Совместимость с большинством типов материалов
• Применяется с материалами с засеянными клетками
• Для производства каркасов требуется дорогое оборудование.
• Оптимизация, необходимая для экспериментальной установки.
. • Некоторые методы печати в настоящее время не обладают высоким разрешением.
Васкулярные системы
Melchiorri et al., 2016; Rabionet et al., 2018; Cui et al., 2019
Trachea
Johnson et al., 2016; Gao et al., 2017; Танигучи и др., 2018; Hsieh et al., 2018; Park et al., 2018; Park et al., 2019; Машино и др., 2019; Xia et al., 2019; Канг и др., 2019; Ан и др., 2019; Gao et al., 2019
• Материал каркаса обладает высокой биосовместимостью
• Внутренние биохимические факторы могут способствовать производству тканевой инженерной модели
• Требуется метод вторичного посева клеток
• Децеллюляризованный каркас может содержать биохимические факторы, которые отрицательно влияют на производство тканевой инженерии модели
• Необходимы обширная характеристика и контроль качества
Сосудистые
McFetridge et al., 2007; Си-Сюнь и др., 2008; Ян и др., 2009; Нефф и др., 2011; Lee et al., 2012
Кишечник
Totonelli et al., 2012
Trachea
Johnson et al., 2016; Батлер и др., 2017; Ghorbani et al., 2017; Чжун и др., 2019; Батиоглу-Караалтин и др., 2019; Хиральдо-Гомес и др., 2019; Wang et al., 2020

Литье

Литье является одним из наиболее часто используемых производственных методов во всей области тканевой инженерии. В основе этой методологии лежит заливка или впрыскивание жидкости в форму, после чего жидкость вызывает образование твердой структуры.Жидкость может быть получена различными способами, включая плавление и отверждение материала (Im et al., 2019), солюбилизацию материала в растворителе и последующее испарение растворителя (Mooney et al., 1995; Opitz et al., 2004; Nieponice et al., 2008; Ma et al., 2010; Zakhem et al., 2012), или перекрестное сшивание (Matsuda, 2004; Guo et al., 2017), или гелеобразование материал в твердую или полутвердую структуру, такую ​​как гидрогель (Wang et al., 2014; Strobel et al., 2018b). Литье также применимо в контексте более сложных технологий формования, таких как формирование труб с помощью вакуума (Singh et al., 2017), так и для образования более сложных структур (Ladd et al., 2018). Как и следовало ожидать, выбранный материал будет диктовать механизм. В случае некоторых гидрогелей, в частности биомолекулярных гелей, например коллагена, фибрина и т. Д., Клетки можно отливать с помощью геля (Seliktar et al., 2003; Swartz et al., 2005; Liu et al., 2007; Naito). et al., 2011; Atchison et al., 2017, 2020). Этот метод удобен и широко применим, поскольку его можно использовать для получения различных геометрических форм и форм с однородными популяциями клеток и он совместим с другими методами производства (Atchison et al., 2017; Iannucci et al., 2019). Однако этап вторичного посева часто все же необходим для создания многослойной клеточной структуры нативных трубчатых тканей, даже при использовании гомогенно засеянных гидрогелей.

В случаях тканевой инженерии включение пор в окончательную структуру часто необходимо для обеспечения доступа засеянных клеток к питательным веществам. Поры могут быть созданы различными способами, но часто создаются с использованием вторичного материала или порогена, который может быть удален путем последующей обработки, оставляя поры на их месте.Различные пористые каркасы были изготовлены с использованием ледяных шаблонов (Boccaccini et al., 2005; Shin'oka et al., 2005; Nieponice et al., 2008; Ma et al., 2010; Zakhem et al., 2012; Chen et al. ., 2015; Roh et al., 2019). Этот процесс включает замораживание раствора или смеси воды и материала каркаса с последующей сублимацией льда, также называемой лиофилизацией, оставляя поры в полученной твердой структуре. В качестве альтернативы поры могут быть получены путем включения ортогонально растворимых твердых веществ в литейный раствор.Например, соль может быть включена в полимерные растворы, отлитые из растворителя, а затем смыта водой после испарения растворителя (Mooney et al., 1995; Sin et al., 2010; Costello et al., 2014). Этот метод применим только для высокопористых материалов, поскольку более низкая пористость будет препятствовать доступу для удаления порообразующих веществ.

Отливка проста, удобна и совместима с широким спектром материалов, с примерами, показывающими применение методов литья для производства сложных моделей со стратифицированными слоями ячеек ().Однако различные факторы могут усложнить процесс литья, в том числе создание более крупных объектов, объектов с непостоянным поперечным сечением или объектов с внутренними полостями. В этих случаях особенно важен дизайн пресс-формы. Наличие вентиляционных отверстий может обеспечить заполнение всей формы. Однако выпуск полученного материала из формы также может быть затруднен в зависимости от материала. Тем не менее, сложные формы можно отливать для создания полезных тканеподобных структур (Wang et al., 2014).Еще одним негативным фактором, влияющим на отливки, особенно полимеры, отлитые из растворителя, и некоторые методы формирования порогенов, является присутствие остаточного растворителя или токсичных порогенов, которые могут отрицательно влиять на рост клеток. Этих проблем можно избежать при правильном обращении и подготовке гипсовой повязки. Как обсуждалось выше, засев ячеек в литые трубы также может быть затруднен. Многие изучают посевные клетки в просвет с помощью пипетки. Однако каркасы часто необходимо вращать (Opitz et al., 2004; Atchison et al., 2017, 2020) или подвергать другой форме динамического посева (Godbey et al., 2004; Nieponice et al., 2008) для достижения однородного посева на внутренней облицовке каркаса. Тем не менее, литье остается широко используемым механизмом для производства трубчатых лесов, учитывая его настраиваемость и широкий спектр доступных материалов. Кроме того, полученные в результате трубчатые каркасы могут быть изготовлены с возможностью повторения и не требуют дополнительных этапов сборки после первоначального литья. Эти факторы делают этот метод широко применимым в области инженерии трубчатых тканей и за ее пределами.

Пример трубчатого каркаса для тканевой инженерии кишечника, сконструированного в процессе литья (Chen et al., 2015). (A) Схема производства строительных лесов. Шелк лиофилизируется в форме для создания пористой основы с центральным просветом. Клетки засевают в каркас и внутрь просвета. (B) Изображение, показывающее просвет каркаса. Масштабная линейка 4 мм. (C) Иммуноокрашивание для ZO-1 и ядер клеток (DAPI). Масштабная линейка 100 мкм. (D) Изображение эпителиальной выстилки на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ). Масштабная линейка 1 мкм. (E) Окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) для определения ферментативной активности ЩФ на внутренней выстилке просвета.Масштабная линейка 200 мкм. (F) Конфокальный z-стек клеток в каркасе, иммуноокрашенном на SM22a, маркер миофибробластов. Масштабная линейка 50 мкм. Изображения были переупорядочены с нескольких панелей, а надписи были изменены для единообразия в рамках этой обзорной статьи (Chen et al., 2015). Эти изображения перепечатаны под международной лицензией Creative Commons Attribution 4.0, доступной по адресу http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Электропрядение

Методы электропрядения включают солюбилизацию полимерного или биомолекулярного материала, который выбрасывается из шприца.Во время процессов электропрядения жидкость заряжается под действием приложенного напряжения и направляется к нейтральной или противоположно заряженной оправке. Растворитель испаряется по мере продвижения материала к оправке, образуя нановолокна. Для формирования трубчатых каркасов оправку обычно вращают во время процесса экструзии. Полученная сетка из нановолокон может быть удалена с оправки, образуя сетку-трубку (Rocco et al., 2014), с примерами создания непрерывных трубчатых структур, совместимых с посевом клеток ().Во многих случаях эти сетки комбинируются с методами вторичного электропрядения, осаждения или литья для изменения свойств и / или структуры каркаса. Процесс электроспиннинга, особенно для производства каркасов, широко освещался в предыдущих обзорах (Pham et al., 2006; Rocco et al., 2014).

Пример процесса электроспиннинга для изготовления трубчатого каркаса для инженерии сосудистой ткани (Lee et al., 2007). (A) Схема процесса электропрядения. (B) Схема прядильной оправки для производства трубчатых лесов. (C) СЭМ-изображение объемного каркаса, полученного из смеси коллагена, эластина и полимеров, при 18-кратном увеличении. (D) СЭМ-изображение каркаса со вставки в (C) при 500-кратном увеличении. (E) Гистологическое окрашивание гематоксилином и эозином каркаса, засеянного гладкомышечными клетками. Изображения были переупорядочены с нескольких панелей, а надписи были изменены для единообразия в рамках этой обзорной статьи (Lee et al., 2007).

Электроформование обеспечивает высокую степень контроля над результирующим размером «пор» сетки и механическими свойствами волокон. Этот процесс также совместим с многочисленными материалами, которые подходят для производства строительных лесов (). Большинство электроспрядных каркасов было произведено с использованием полимеров или полимеров, смешанных с белками ЕСМ (Vaz et al., 2005; Buttafoco et al., 2006; Lee et al., 2007; Smith et al., 2008; Wang et al., 2009). ; Yoon, Kim, 2010, 201; Han et al., 2011; Du et al., 2012; Hinderer et al., 2012; Zhang et al., 2013; Knight et al., 2013; Fu et al., 2014; Отт и др., 2016; Махони и др., 2016; Чжоу и др., 2016; Wu et al., 2017; Ju et al., 2017; Best et al., 2018; Strobel et al., 2018a; O’Leary et al., 2020). Однако некоторые каркасы содержат исключительно утилизированные белки (Boland et al., 2004). Каркасы из электропряденого волокна страдают теми же недостатками, что и отлитые каркасы, описанными выше, а именно токсичностью от остаточного растворителя и потенциальными трудностями при гомогенном посеве клеток.Однако оба эти критерия были тщательно изучены. Техника, аналогичная электропрядению, называемая формованием геля, также использовалась для производства трубчатых каркасов, когда высоковязкие гели экструдируются на прядильную оправку (Lovett et al., 2008; Rodriguez et al., 2019). Как правило, электроспиннинг и другие подобные методы широко и успешно применялись для производства трубчатых каркасов.

Прокатка

Механизмы прокатки включают прокатку плоского субстрата в трубу.Вальцовка обычно выполняется с помощью оправки для ручного катания подложки. Тем не менее, в некоторых исследованиях были созданы трубки со слоями слоистых клеток с использованием механизма самосборки, основанного на свойствах нижележащего субстрата (). В некоторых из более ранних исследований по производству трубчатых каркасов для тканевой инженерии использовались методики прокатки. Как правило, эти исследования производят полимерный лист и сшивают лист в трубку (Niklason and Langer, 1997; Niklason et al., 1999; Niklason et al., 2001; Gui et al., 2011; 2016). В других исследованиях было разработано использование листов внеклеточного матрикса, полученных из клеток, которые сворачивали в трубки с помощью оправки (L'Heureux et al., 1998, 2006; Pricci et al., 2009; Konig et al., 2009; Gauvin et al. 2010; Jung et al., 2015). Этот подход был особенно интересен тем, что в нем использовались только биологические материалы. В этих исследованиях клетки, продуцирующие ЕСМ, выращивали до слияния. Полученный в результате лист ECM был затем отсоединен и свернут в трубку, куда можно было засеять дополнительные клетки. В одном исследовании использовался электроспрядный каркас для помощи в свертывании клеточного листа в трубчатую конструкцию (Rayatpisheh et al., 2014). Другие исследования также были сосредоточены на прокатке полимерных листов вокруг оправки (Shen et al., 2003; Wang et al., 2016b, 2018). Совсем недавно группы разработали самосборные трубки. Механизмы самосборки или другие стратегии прокатки, которые могут выполняться в стерильных условиях, имеют главное преимущество, позволяя проводить засева клеток перед прокаткой. В этих исследованиях прокатка начинается с использования либо механически натянутых листов, связанных (Cheng et al., 2017), либо полимеров с памятью формы (Zhao et al., 2018). В любом из этих сценариев клетки можно гомогенно засеять и культивировать в 2D, а затем свернуть в 3D-пробирку ().Эта стратегия позволяет эффективно продуцировать конфлюэнтный монослой эпителиальных клеток на структуре, легко совместимой с типичными методами культивирования клеток, при этом в конечном итоге создавая структуру, сконструированную из трубчатой ​​ткани. Однако после того, как конструкция свернута, необходимо решить проблему герметизации трубы от свободных краев прокатанного субстрата. Многие стратегии просто используют многослойные пробирки, но этот подход может потенциально ограничить доступ среды к базальной стороне засеянных клеток.В качестве альтернативы трубки можно закрыть сшиванием, как описано выше, или путем использования герметика для герметизации свободных краев трубки (Grikscheit et al., 2002, 2004). Прокатка - это, пожалуй, единственный производственный метод, который наиболее конкретно применяется при производстве трубчатых строительных лесов, и, как таковой, оказал значительное влияние на эту область.

Пример процесса скручивания трубчатой ​​конструкции, сконструированной из сосудистой ткани (Cheng et al., 2017). (A – I) Схематическое изображение процесса производства засеянных клетками, индуцированной стрессом скручивающейся мембраны (SIRM). (A – C) Подложка из поли (диметилсилоксана) (PDMS) покрыта сополимером поли (DL-лактид-гликолид) (PLGA) и поли (ε-капролактон) (PCL) посредством электропрядения (ES) под высоким напряжением. (HV). (D – F) Полученный субстрат засевают эндотелиальными клетками (ЭК), гладкомышечными клетками (ГМК) и фибробластами. (G – I) Каркас отделяется от предварительно напряженной основы, вызывая скатывание. (J, K) Результирующие слоистые слои клеток в свернутом субстрате: ЭК показаны зеленым, SMC показаны синим, а фибробласты показаны пурпурным.Изображения были переупорядочены с нескольких панелей, а надписи были изменены для единообразия в рамках этой обзорной статьи (Cheng et al., 2017).

3D-печать

3D-печать, также известная как аддитивное производство или биопечать в некоторых случаях тканевой инженерии, представляет собой процесс формирования трехмерной структуры послойным способом. Процессы печати обычно включают экструзию материала из сопла или фото-сшивание объекта из жидкого предшественника. В 3D-печати на основе экструзии жидкий материал, аналогичный тем, которые используются для литья, выдавливается из сопла на платформу.Сопло следует по производственному пути через платформу, образуя единственный слой окончательной желаемой формы. После того, как этот слой затвердел, сопло выбрасывает второй слой материала поверх исходного слоя, тем самым создавая трехмерный объект (Zhu et al., 2016). Этот тип 3D-печати совместим с большинством типов материалов, включая гидрогели и гидрогели, содержащие живые клеточные популяции. В одном исследовании использовались полимерные каркасы и гидрогели с засеянными клетками для создания слоистых структур, содержащих несколько популяций клеток, для создания тканевой инженерии трахеи ().Для биопечати гидрогели с засеянными клетками или другие пригодные для печати материалы, совместимые с клетками, часто называют биочерками. Однако в зависимости от материала могут потребоваться специализированные принтеры. Другой формат 3D-печати включает фото-сшивание прекурсора полимера из жидкой ванны. В этих принтерах предшественник сшивается и сплавлен с базовой пластиной, которая перемещается в трехмерном пространстве по мере того, как последующие слои сшиваются на исходный слой, создавая таким образом трехмерные структуры. Этот тип печати обычно выполняется с использованием фотоинициализированного сшивающего агента, что означает, что выбор материалов ограничен теми, которые могут быть сконструированы как таковые.Струйная печать также часто используется в биологических приложениях, но этот тип печати обычно несовместим с созданием больших трехмерных каркасов, подобных тем, которые используются для тканевой инженерии, и поэтому здесь не обсуждается. Разрабатываются и другие новые виды печати, которые, несомненно, применимы к производству трубчатых каркасов. В различных обзорах особое внимание уделяется 3D-печати для тканевой инженерии и доступным методам (Wang et al., 2015; Zhu et al., 2016; Galliger et al., 2019).

Пример процесса 3D-печати для создания тканевой инженерии трахеи (Park et al., 2019). (A) Изображение, показывающее трехмерную печать альгината в совместимом с клетками гидрогеле. (B) Изображение трахеи, напечатанной на 3D-принтере. Каркас состоял из 5 слоев (от самого внутреннего до самого внешнего): сетка из поли (капралактона), альгинатный гидрогель, содержащий первичные назальные эпителиальные клетки, цилиндрический узор из поли (капралактона), альгинатный гидрогель, содержащий первичные ушные хондроциты, сетчатый узор из поли (капралактона). (C) SEM-изображение, показывающее пластинчатую структуру каркаса. (D – F) Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие многослойные клеточные слои в поперечном сечении каркаса. Эпителиальные клетки показаны зеленым, а хондроциты - красным. Изображения были переупорядочены с нескольких панелей, а надписи были изменены для единообразия в рамках этой обзорной статьи (Park et al., 2019). Эти изображения перепечатаны в соответствии с международной лицензией Creative Commons Attribution 4.0, доступной по адресу http: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /.

Основным преимуществом процесса 3D-печати является возможность легко настраиваемых каркасов и, при использовании совместимых принтеров, потенциальных материалов для печати, содержащих живые клетки (Park et al., 2019; Cui et al., 2019). В отличие от литья, этот тип биопечати более легко совместим с созданием стратифицированных слоев клеток. Однако разрешение биопринтеров часто ограничено из-за вязких свойств биомолекулярных прегелевых растворов. Исследования непосредственно изучали оптимизацию этих свойств для повышения эффективности биопечати (Diamantides et al., 2019). За исключением биопечати, другие 3D-печатные каркасы страдают теми же недостатками в посеве клеток, что и литые или электроспряденные каркасы, но все же могут создавать функциональные трубчатые каркасы (Melchiorri et al., 2016; Gao et al., 2017; Rabionet et al., 2018; Hsieh et al., 2018; Park et al., 2018; Xia et al., 2019). Методологии 3D-печати также совместимы с другими методами, обсуждаемыми в этом обзоре. Например, в одном исследовании основное внимание уделялось созданию каркаса, напечатанного на 3D-принтере, который затем был отлит из гидрогеля с клетками посредством литья (Gao et al., 2019). В другом исследовании использовалось сочетание методов 3D-печати и электроспиннинга (Ahn et al., 2019). В настоящее время исследования все больше фокусируются на использовании 3D-печати для создания сосудистых структур (Abaci et al., 2016; Lei et al., 2019), которые потенциально могут быть использованы для обеспечения питательными веществами более крупных структур, таких как модели кишечника. Недавно в некоторых исследованиях была напечатана трахея непосредственно с использованием культур сфероидных клеток (Taniguchi et al., 2018; Machino et al., 2019). Эти и другие исследования демонстрируют широкую применимость и актуальность 3D-печати в различных областях этих областей.

Децеллюляризация

Децеллюляризация включает производство каркаса из нативной ткани. Эта область охватывает широкий спектр приложений, от децеллюляризации всего органа (Gilbert et al., 2006; Crapo et al., 2011) до децеллюляризации определенных тканей и разработки этих структур для других целей (Lee et al., 2012; Boys). и др., 2019). Обычно децеллюляризация происходит через объяснение нативной ткани и затем лечение для полного удаления клеток из ткани.Для удаления клеток ткань обычно подвергают серии промывок ферментами или детергентами для лизирования и удаления нативной популяции клеток. После удаления полученные ткани дополнительно промывают или лиофилизируют, чтобы подготовить структуру в качестве каркаса для тканевой инженерии (Gilbert et al., 2006). В приложениях тканевой инженерии децеллюляризованные каркасы могут использоваться для трансплантации или имплантации аллотрансплантата. Однако каркас также необходимо повторно засеять соответствующей клеточной популяцией, чтобы воспроизвести желаемую тканевую систему in vitro (McFetridge et al., 2007; Си-Сюнь и др., 2008; Ян и др., 2009; Нефф и др., 2011; Zang et al., 2013; Bertanha et al., 2014). Рецеллюляризация часто достигается за счет перфузии каркаса новой клеточной популяцией. Методы децеллюляризации не предназначены исключительно для тканей млекопитающих. Некоторые исследования показали, что жизнеспособные клетки прикрепляются и растут на целлюлозных каркасах, полученных из аппликаций (Modulevsky et al., 2014).

Децеллюляризация имеет множество преимуществ. Во-первых, каркас по своей природе будет состоять из высокобиосовместимого материала, который может способствовать производству ткани и созреванию каркаса, при этом исследования показывают, что аналогичные клеточные популяции могут быть эффективно повторно засеяны на децеллюляризованные каркасы.Как правило, эти леса также обладают достаточной механической прочностью для конкретного применения, учитывая их происхождение. Каркасы также, вероятно, будут содержать связанные с матриксом факторы роста и другие биохимические сигналы, которые могут влиять на поведение клеток при повторном посеве (Zhou et al., 2020). Некоторые исследования также сконструировали клеточные листы, децеллюляризовали эти листы, а затем использовали их для повторного посева новой клеточной популяцией (L’Heureux et al., 1998; Quint et al., 2011). Этот подход может производить полностью биологически полученные каркасы () с особым преимуществом потенциального использования только аутологичных клеток и компонентов.Децеллюляризация использовалась совместно со многими другими методами производства трубчатых каркасов. Одно исследование обернуло засеянный клетками электропряденый каркас вокруг децеллюляризованной аорты, снабженный литым полимерным стентом в качестве механической опоры для инженерии ткани трахеи (Ghorbani et al., 2017).

Пример сконструированного децеллюляризованного каркаса для сосудистой инженерии (Quint et al., 2011). Каркасы получали посевом гладкомышечных клеток на сетку из поли (гликолевой кислоты). Каркасы культивировали до тех пор, пока клетки не продуцировали непрерывный ЕСМ по всей сетке, и сетка почти полностью не разрушилась.На этом этапе каркасы были децеллюляризованы, что привело к получению трубчатого каркаса ECM, происходящего из клеток. В конце концов, каркасы были повторно засеяны эндотелиальными клетками и имплантированы модели свиньи. (A) Изображение децеллюляризованного трубчатого каркаса. (B) Гистологическое окрашивание поперечного сечения каркаса гематоксилином и эозином. Окрашивание гематоксилином и эозином микроструктуры каркаса (C) до децеллюляризации и (D) после децеллюляризации. Масштабные линейки 500 мкм.Порядок изображений был изменен с нескольких панелей, а надписи были изменены для единообразия в рамках этой обзорной статьи (Quint et al., 2011).

Децеллюляризованная ткань также обычно в некоторой степени сохраняет свою естественную структуру (Totonelli et al., 2012), что может быть полезно. Однако результирующие свойства децеллюляризованной ткани, вероятно, будут изменены во время процесса децеллюляризации (Partington et al., 2013). Децеллюляризованные ткани необходимо подвергнуть значительной характеризации, чтобы гарантировать, что полученный каркас по-прежнему может использоваться в желаемом приложении.Во многих исследованиях использовались децеллюляризованные ткани, происходящие из регионов, отличных от конечной области применения, то есть использование децеллюляризованной амниотической мембраны в качестве сосудистой основы (Lee et al., 2012). Хотя эта стратегия может быть очень эффективной, присутствие связанных с матрицей факторов роста, которые не связаны с желаемой тканью, может повлиять на поведение вновь засеянных клеток. Основным недостатком использования децеллюляризованных каркасов является поиск ткани для децеллюляризации.Обычно исследователи используют ксенотрансплантаты, которые потенциально могут инициировать отрицательные ответы в зависимости от происхождения каркаса и повторно засеянных клеток. Во-вторых, использование ткани, полученной из организмов, может вызвать высокую вариабельность между каркасами. Однако при надлежащем контроле качества и анализе децеллюляризованные каркасы становятся мощным инструментом тканевой инженерии трубчатых систем.

Другие методы

Существуют различные другие методы моделирования трубчатых систем. Наиболее заметным из них является использование микрофлюидных систем.Микрожидкостные системы обычно используют культуру клеток 2D, которая совместима с культурами эпителия. Таким образом, различные достижения в нашем понимании клеточных механизмов были достигнуты с помощью микрофлюидики. Эти структуры, как правило, не являются трубчатыми или трехмерными, и поэтому мы не включили их в наш обзор доступных производственных механизмов для тканевых каркасов. Однако микрофлюидные технологии для эпителиальной инженерии были подробно рассмотрены в других источниках (Wong et al., 2012; Ahadian et al., 2018).

Современное состояние в области конструирования трубчатых тканей

Здесь мы обсуждаем конкретные применения методов производства, описанных выше. Как упоминалось во введении, мы сосредоточимся на тканевой инженерии сосудов, кишечника и трахеи, особенно с учетом систем, которые применяются в тестировании и открытии лекарств.

Сосудистые системы

Сосудистая сеть - одна из наиболее часто используемых тканевой инженерией структур в организме.О сосудистой сети тканевой инженерии были написаны различные обзоры (Nerem, Seliktar, 2001; Stegemann et al., 2007; Song et al., 2018), причем обзоры даже написаны специально об использовании электроспиннинга для тканевой инженерии сосудов (Rocco et al., 2014). Здесь мы стремимся выделить некоторые инновации в инженерии сосудистой ткани с точки зрения производства трубчатых каркасов в дополнение к обсуждению недавних подходов.

Многие тканеинженерные модели сосудов полагаются на популяцию гладкомышечных клеток, чтобы произвести соответствующий ECM на опоре каркаса (Seliktar et al., 2003; Макфетридж и др., 2007; Ли и др., 2007; Nieponice et al., 2008; Zhang et al., 2013; Strobel et al., 2018a). Однако в некоторых системах для этой цели также используются фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки или другие стволовые клетки-предшественники (Shin'oka et al., 2005; Vaz et al., 2005; Wang et al., 2009; Rayatpisheh et al. , 2014; Bertanha et al., 2014; Jung et al., 2015; Gui et al., 2016; Rabionet et al., 2018; Strobel et al., 2018b). Большая часть литературы, посвященной дизайну сосудов, нацелена на конечное использование структуры в качестве имплантата или сосудистого трансплантата.Эта цель делает возможным эндотелизацию структуры in vivo . Однако в настольные модели также должны быть включены эндотелиальные клетки. В некоторых моделях использовались только эндотелиальные клетки (Matsuda, 2004; Lovett et al., 2007; Xi-Xun et al., 2008; Zhang et al., 2013; Wang et al., 2014; Zhou et al., 2016; Zhao et al., 2018), но многие из более сложных моделей включают совместное культивирование эндотелиальных клеток с типом депонирующих ECM клеток (Niklason and Langer, 1997; L'Heureux et al., 1998; Никласон и др., 1999; Боланд и др., 2004; Опиц и др., 2004; Swartz et al., 2005; L’Heureux et al., 2006; Ловетт и др., 2008; Ян и др., 2009; Нефф и др., 2011; Хан и др., 2011; Cheng et al., 2017; Ju et al., 2017; Атчисон и др., 2017; Cui et al., 2019; Атчисон и др., 2020).

Учитывая слоистую структуру нативных кровеносных сосудов (), многие модели используют подход, при котором сначала засевается тип клеток, образующих ЕСМ, за которым следует этап вторичного посева эндотелиальных клеток.Этот метод посева совместим практически с любой трубчатой ​​конструкцией лесов. В более ранней модели тканевой инженерии сосудистой сети использовалась серия из трех слоев, имитирующих естественную сосудистую структуру. Основа для каркаса была сформирована через клеточный лист, полученный из фибробластов, который был свернут в многослойную трубку. Слои сливались в культуре перед последующей дегидратацией, что приводило к децеллюляризации для дальнейшего посева. Эту опорную трубку оборачивали вторым живым листом фибробластов с последующей инъекцией эндотелиальных клеток в просвет, после чего сосуд подвергался сдвигу жидкости (L’Heureux et al., 2006). Эта модель не использовалась в качестве настольной системы, но в конечном итоге была имплантирована людям (L’Heureux et al., 2007), что значительно продвинуло вперед область инженерии сосудистой ткани. Однако этот метод, в целом успешный, потребовал длительного периода культивирования (~ 28 недель) для создания окончательного сосуда.

Различные ранние исследования подтвердили использование стратифицированных слоев клеток в инженерии сосудистой ткани, особенно в отношении различных методологий построения трубчатых каркасов.Некоторые исследования были сосредоточены на начальном засеивании каркаса гладкомышечными клетками или фибробластами (Boland et al., 2004; Yang et al., 2009; Neff et al., 2011). В других исследованиях использовались совместимые с клетками методы литья под давлением для создания тканеподобной структуры в качестве каркаса (Swartz et al., 2005; Liu et al., 2007). Некоторые из этих исследований смогли продемонстрировать реакцию гладкомышечных клеток на вазоактивные реагенты, что указывает на потенциал этих конструкций для тестирования лекарств (Swartz et al., 2005; Liu et al., 2007). Однако в этих конкретных исследованиях были получены структуры, в которых не было эндотелия для этих тестов (Swartz et al., 2005; Liu et al., 2007), что ограничивало сходство с нативной тканью. В более недавнем исследовании использовалась техника перекатывания для получения медиальных / адвентициальных областей кровеносного сосуда (Jung et al., 2015). Мезенхимальные стволовые клетки использовали для получения клеточных листов, которые свернули в трубку с четырьмя концентрическими слоями. Эти листы сливались во время культивирования в биореакторе. Затем в просвет засевали популяцию эндотелиальных клеток-предшественников и культивировали в условиях потока.Воздействие на сосуды сосудосуживающего средства, фенилэфрина, вызывало суживающую реакцию клеток. Сосуды также расширялись при увеличении кровотока. В исследовании также изучалась адгезия моноцитоподобных клеток при воздействии на сосуд TNF-α, воспалительного цитокина. TNF-α может активировать продукцию молекул адгезии на стенках сосудов, чтобы способствовать связыванию лейкоцитов. Повышенное связывание наблюдалось для этой системы при воздействии TNF-α. Однако исследователи не анализировали их структуры на предмет образования эндотелиальных соединений (Jung et al., 2015).

Другое исследование было сфокусировано на разработке биочернилы и системы коаксиального экструзионного принтера для прямой печати трубчатых структур, содержащих клетки (Cui et al., 2019). В этой установке стенки полученного сосуда были сконструированы из сшитого метакрилата желатина, содержащего гладкомышечные клетки. Просвет был сформирован путем экструзии Pluronic F127, биоинертного полимерного поверхностно-активного гидрогеля, который может растворяться при определенных условиях и содержит эндотелиальные клетки.Структуре давали возможность застыть перед тем, как слой плюроника F127 был удален из просвета. Во время процесса удаления некоторые из эндотелиальных клеток прилипли к внутренним стенкам просвета, в результате чего образовался слой метакрилата желатина, содержащий гладкомышечные клетки с внутренней выстилкой из эндотелиальных клеток, оставшихся после очистки просвета. Проницаемость сосудов оценивалась на аналогичных структурах, имеющих нетубулярную геометрию, и было обнаружено, что эндотелиальный слой показал пониженную проницаемость.Структуры также подвергались воздействию сосудорасширяющего средства, ацетилхолина, и при воздействии на них обнаружилось расширение (Cui et al., 2019). Основным преимуществом структур, созданных таким способом или подобными способами, является широкий спектр возможных форм и каналов, которые можно создать с помощью 3D-печати. В исследованиях все больше внимания уделяется развитию микрососудов (Wang et al., 2014; Abaci et al., 2016; Lei et al., 2019), которые могут обеспечить более реалистичную среду в других моделях, таких как кишечник.

Были также созданы различные модели для имитации и изучения конкретных болезненных состояний. Сосудистая сеть с тканевой инженерией была разработана для моделирования синдрома прогерии Хатчисона-Гилфорда (HGPS), который связан с повышенной распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний и связан с дисфункциональными гладкомышечными клетками в сосудистой сети (Atchison et al., 2017, 2020). Эта модель была разработана с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и эндотелиальных клеток-предшественников. ИПСК были получены из здоровых фибробластов или фибробластов с мутацией HGPS, а затем дифференцированы в направлении гладкомышечных клеток.Сосудистая сеть с тканевой инженерией была сконструирована путем инъекции коллагена, содержащего гладкомышечные клетки, в форму с последующим гелеобразованием коллагена, засеянного клетками. Затем предшественники эндотелия перфузировали в просвет для посева (Atchison et al., 2017, 2020). Авторы смогли наблюдать различия в вазоактивности между здоровыми и больными клетками, что контролировалось путем изучения вазодилатации и вазоконстрикции с использованием ацетилхолина и фенилэфрина соответственно (Atchison et al., 2020). Это и другие исследования подчеркивают большой потенциал использования тканевой инженерии сосудов в качестве модели для тестирования / открытия лекарств.

Кишечные системы

Инженерия кишечной ткани представляет собой особенно сложную область, связанную с трудностями создания функционального кишечного эпителия, учитывая многочисленные типы эпителиальных клеток, присутствующих в естественном кишечнике. Кроме того, кишечник имеет сложное трехмерное поперечное сечение ворсинок и крипт, которое также связано с распределением клеток в кишечнике (Santos et al., 2018). Чтобы воссоздать эти структуры, в многочисленных исследованиях были разработаны модели кишечника с использованием микрофлюидики или субстратов для двумерных культур клеток.Однако эти модели не полностью имитируют сложную природную среду кишечника (Bein et al., 2018). Также были разработаны трехмерные модели тканевой инженерии, которые позволяют воспроизвести некоторые аспекты нативного кишечника.

Некоторые из более ранних тканевых инженерных моделей кишечника были разработаны путем свертывания полимерных трубок и засева этих каркасов органоидами, полученными из нативной толстой кишки мышей. Эти структуры были успешно трансплантированы крысам (Grikscheit et al., 2002). Эти структуры также использовали для лечения индуцированного синдрома короткой кишки у крыс. Созданные тканями структуры были полезны для выживания и функции кишечника по сравнению с фиктивным контролем (Grikscheit et al., 2004). Эти исследования показали возможность разработки дополнительных настольных моделей тканевой инженерии.

На одной из моделей были разработаны нетрубчатые трехмерные геометрии ворсинок и крипт с использованием техники литья (Yu et al., 2012). Конструирование каркаса выполняли путем нанесения коллагена на негатив структуры ворсинок-крипт.Эти структуры были засеяны клеточной линией, подобной энтероцитам (клетки Caco-2), и проанализированы в сравнении с плоской системой, то есть без ворсинок. Проницаемость ячеистых структур была измерена с использованием электрических измерений I и проницаемости двумя лекарствами, обнаружив более высокие коэффициенты проницаемости в трехмерных структурах (Yu et al., 2012). Этот экспериментальный план с тех пор использовался с различными другими материалами, в основном пористыми полимерными структурами, для мониторинга воздействия бактериальной культуры на энтероциты (Costello et al., 2014; Ladd et al., 2019) и недавно был сформирован в трубчатые структуры для имплантации (Ladd et al., 2018).

Пожалуй, одна из наиболее полных тканеинженерных трубчатых моделей была разработана для кишечника с использованием клеточно-стратифицированного шелкового каркаса (Chen et al., 2015) с биореактором, предназначенным для имитации перистальтики кишечника (Zhou et al., 2018) . Метод литья был использован для создания трубчатых шелковых каркасов (). Первичные кишечные миофибробласты высевали внутри коллагена в шелковый каркас, а затем внутренний просвет выстилали совместной культурой энтероцитоподобной клеточной линии (Caco-2) и бокаловидной клеточной линии (HT29-MTX) путем инъекции в просвет.Полученные в результате культуры показали образование слизи и образование плотных стыков во всем слое эпителиальных клеток. Кроме того, был обнаружен внутрипросветный градиент кислорода (Chen et al., 2015). Итерации на этой модели также включали колоноидный эпителий (Chen et al., 2017) с культурами моноцитов и исследование инфильтрации макрофагов через эпителий (Roh et al., 2019). Биореактор был также разработан и применен к этой системе для обеспечения пульсирующей, перистальтической стимуляции этих конструкций (Zhou et al., 2018).

Многие другие нетрубчатые системы также успешно смоделировали различные аспекты желудочно-кишечного тракта. Например, была разработана обширная биореакторная система для моделирования микробных популяций кишечника (Van den Abbeele et al., 2012). Недавно разработанная микрофлюидная модель также смогла воспроизвести эпителий кишечника и связанную микробную популяцию с прилегающей сосудистой структурой (Jalili-Firoozinezhad et al., 2019). Такой дизайн привел к формированию структуры ворсинок-крипт с поляризованными эпителиальными клетками.Это устройство также включает датчики для неинвазивного мониторинга содержания кислорода, что позволяет отслеживать градиенты кислорода между просветом кишечника и соседними полостями просвета сосудов (Jalili-Firoozinezhad et al., 2019). Эти типы устройств особенно полезны в качестве платформ фундаментальной науки и могут помочь при проектировании более крупных трубчатых систем. В настоящее время многие модели кишечника с тканевой инженерией сосредоточены на исследовании микробиома кишечника или иммунных компонентов. По мере дальнейшего развития этих моделей и улучшения нашего понимания некоторых из этих аспектов биологии кишечника внимание, вероятно, сместится к тестированию лекарств в этих тканевых инженерных системах.

Трахеальные системы

В отличие от in vitro моделей , обсуждаемых для сосудистой сети и кишечника, перспективы инженерии трахеальной ткани на сегодняшний день в основном касаются имплантируемых каркасов для замены трахеи. В последние годы исследования были направлены на улучшение методов приготовления in vitro , таких как оптимизация децеллюляризации с помощью ферментативных, детергентных (Zhong et al., 2019), вакуумных (Butler et al., 2017) и химических методов. (Батиоглу-Караалтин и др., 2019). Например, улучшенные ферментативные подходы резко сократили время децеллюляризации трахеи (Giraldo-Gomez et al., 2019; Wang et al., 2020). Важно отметить, что сокращение времени подготовки не оказало неблагоприятного воздействия на структуру или биомеханические свойства трахеального внеклеточного матрикса и позволило избежать иммуногенных или воспалительных реакций при имплантации in vivo. Этот результат подчеркивает перспективность передовых методов децеллюляризации для производства трахеальных имплантатов. Несмотря на успех в этих областях, методы децеллюляризации требуют наличия доноров трахеи человека, а децеллюляризованные каркасы могут обладать измененными механическими свойствами по сравнению с нативными (Partington et al., 2013).

Основным требованием к тканевой инженерии трахеи является достаточная механическая поддержка, чтобы противостоять давлению. Таким образом, многие модели трахеи с тканевой инженерией были созданы путем сочетания различных методов производства, включая механическую опорную структуру с каркасом для посева клеток. Тканевая инженерия трахеи была произведена с использованием комбинации методов 3D-печати и децеллюляризации (Johnson et al., 2016). Этот подход предлагает множество преимуществ, включая улучшенную структурную и механическую поддержку по сравнению с одной децеллюляризованной тканью, при сохранении биосовместимости и нативного ECM.Эти гибридные децеллюляризованные каркасы, напечатанные на 3D-принтере, показали сопоставимую устойчивость к сжатию по сравнению с нативной тканью и более высокую устойчивость к сжатию по сравнению с одним децеллюляризованным каркасом (Johnson et al., 2016). Каркасы, полученные с помощью комбинации 3D-печати и электроспиннинга, также обладали достаточной механикой (угол поворота, модуль упругости, коэффициент удлинения и предел прочности) для рекапитуляции трахеи, при этом демонстрируя высокую степень клеточного прикрепления (Ahn et al., 2019). В других исследованиях имитировалась естественная структура трахеи путем включения С-образных колец в напечатанные на 3D-принтере трубчатые конструкции, таким образом создавая механические профили, аналогичные in vivo (Ott et al., 2016; Best et al., 2018).

Другие исследования были направлены на то, чтобы охарактеризовать биосовместимость и регенеративные способности трансплантатов трахеи посредством трансплантации на кроличьих моделях. Например, методы 3D-литья на основе растворителя использовались для изготовления трубчатых каркасов, которые демонстрируют васкуляризацию и дифференциацию реснитчатого, продуцирующего слизь эпителия трахеи через 4 недели после имплантации (Park et al., 2015). Точно так же трехмерная биопечать трубчатой ​​ткани трахеи, содержащей слои PCL и аутологичных эпителиальных клеток и хондроцитов (), продемонстрировала полную регенерацию респираторного эпителия и долгосрочную стабильность функции трахеи (Park et al., 2019). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить возможность неблагоприятных иммунных или воспалительных процессов и способствовать регенерации хондроцитов хряща для механической поддержки. Кроме того, необходим достаточный поток воздуха в просвете и газонепроницаемость (Hsieh et al., 2018) и имеет решающее значение для успеха трахеальных имплантатов, когда они расположены на естественной границе раздела воздух-жидкость.

Таким образом, многие исследования показали успешное изготовление многослойных, гибких и структурно поддерживающих трубчатых моделей трахеи с характеристиками и сравнениями, выполненными in vitro с использованием таких методов, как микроскопия высокого разрешения, иммунофлуоресценция, гистологическое окрашивание и механическое тестирование. Хотя некоторые исследования были направлены на изучение микробных свойств и реакции на вторжение патогенов (Kang et al., 2019), на сегодняшний день большинство тканеинженерных модельных систем трахеи сосредоточено на разработке имплантируемых каркасов. Ограниченные примеры моделей, которые относятся к токсикологии или тестированию наркотиков, могут быть связаны с трудностью создания трехмерной границы раздела воздух-жидкость in vitro . Кроме того, использование высокопроизводительных микрофлюидных и 2D-систем для стимуляции и открытия лекарств хорошо зарекомендовало себя в этой области (Ahadian et al., 2018).

Перспективы на будущее

Область тканевой инженерии для трубчатых систем за свою историю претерпела различные инновационные шаги.Тем не менее, тканевые модели все еще не полностью напоминают нативные ткани. Это отсутствие сходства частично связано с многочисленными типами клеток, которые требуют представления. Например, немногие системы включают нервные и иммунные компоненты, которые все больше связаны с функцией тканей и гомеостазом (Veiga-Fernandes and Artis, 2018). Кроме того, в тканевой инженерии кишечника для создания только эпителия необходимы многочисленные типы клеток, что может значительно усложнить процесс культивирования. Дальнейшие инновации в производстве строительных лесов могут решить эти проблемы.Биопечать может потенциально расслоить различные типы клеток, увеличивая возможность получения клеточно-сложных систем. Однако стоимость производства или покупки биопринтера, способного создавать такие многослойные структуры, в настоящее время слишком высока, чтобы быть широко доступными. Таким образом, инновации в окружающих технологиях, например, системы с несколькими соплами, интегрированные возможности культивирования и т. Д., Могут значительно повысить осуществимость. Другие методы, предполагающие самосборку трубок, позволяют решить некоторые из этих задач с меньшими затратами.Исследователи также должны рассмотреть возможность производства модульных систем для повышения сложности модели. Разработка каркасов, которые могут быть помещены в совместное культивирование по достижении зрелости, позволяет проводить более широкий диапазон условий культивирования и экспериментов, не обязательно требуя дорогостоящего производственного оборудования.

Другие факторы, усложняющие текущие усилия в инженерии трубчатых тканей, включают применение условий, подобных нативным, к полученным каркасам. Например, в то время как в некоторых исследованиях были разработаны условия культивирования, подобные естественным, с использованием биореакторов (Zhou et al., 2018), большинство исследований полагаются на условия среды для создания моделей тканей. Многие из клеток, присутствующих в этих системах, являются механореактивными, о чем свидетельствуют динамические физиологические условия in vivo , что указывает на то, что дополнительные стимулы должны применяться для достижения нативных условий in vitro . В связи с этим конкретным ограничением при разработке дизайна исследования необходимо учитывать совместимость каркаса с последующей системой биореактора. Каркасы потенциально могут быть изготовлены внутри биореактора с использованием многих из вышеперечисленных методов, таких как литье и печать.В качестве альтернативы каркасы могут быть изготовлены из компонентов динамического материала, таких как пьезоэлектрические материалы, которые потенциально могут создавать механические стимулы для каркасов, используя присущие материалу свойства.

Последним элементом, который следует рассмотреть для повышения эффективности трубчатых каркасов, является разработка стенок каркасов для создания множественных клеточных микросредов внутри одного каркаса. Например, могут быть изготовлены каркасы для поддержки формирования микрососудов (Chang and Niklason, 2017). Использование такого каркаса в инженерии тканей кишечника может обеспечить клетки питательными веществами через каналы микрососудов, что теоретически может упростить конструкции биореакторов с объемной жидкостью.Подобные концепции могут быть применены к инженерии трахеальной ткани при разработке каркасов, которые могут поддерживать образование хряща, одновременно обеспечивая поверхность для образования эпителия. Многие методы производства каркасов, представленные в этом обзоре, имеют потенциал для микроструктурной инженерии в объеме каркасов, и учет желаемой микросреды при разработке процесса изготовления может иметь значительные преимущества в конечных результатах.

По мере того, как тканевые трубчатые системы развиваются в направлении функциональных тканей, эти системы могут использоваться для тестирования и открытия лекарств.Многие системы уже начали проявлять активную реакцию на различные лекарства (Jung et al., 2015; Atchison et al., 2017, 2020). Однако основным фактором, которого все еще не хватает, является возможность контролировать эти системы в режиме реального времени. Большинство систем тканевой инженерии, особенно с трехмерными структурными особенностями, требуют анализа конечных точек. В исследованиях обычно используются аналитические методы, такие как иммуноокрашивание или блоттинг, для определения клеточного ответа и активности в тканевой инженерной системе. Хотя эти методы очень полезны и информативны, они также могут привести к увеличению периода исследования, поскольку часто требуют титрования или большего количества образцов для достижения достаточной статистической мощности для анализа.

Некоторые исследования начали включать неинвазивные методы, такие как электрические измерения, которые можно проводить во время посева. Эти методы предоставляют данные о тканевой инженерной системе в режиме реального времени, которые можно сравнить с типичным анализом конечных точек. Например, распространенным методом оценки образования эпителиального барьера со ссылкой на исследования лекарств или токсикологии является трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) (Benson et al., 2013; Srinivasan et al., 2015). Однако устройства TEER несколько ограничены из-за жесткой конструкции электродных зондов, которая не соответствует сложной архитектуре современных моделей тканевой инженерии.Другие распространенные средства для мониторинга тканеинженерных трубчатых моделей включают различные анализы материалов, такие как механический анализ, или биологические аналитические методы, такие как гистология и иммуноокрашивание. Однако эти методы также труднее применять в трубчатых каркасах из-за их геометрии, что еще больше усложняет оценку в этих тканевых инженерных системах. В ответ на эти ограничения были продемонстрированы некоторые инновационные решения, включая использование электроактивного полимерного каркаса, который может отслеживать адгезию, рост и миграцию клеток в режиме реального времени во время культивирования (Pitsalidis et al., 2018), с потенциалом для трубчатой ​​установки для тканевой инженерии. Кроме того, электроды были изготовлены в устройствах «орган на кристалле» (Henry et al., 2017), микрофлюидике (Curto et al., 2017) и гибких полимерных подложках (Ferro et al., 2019; Kalmykov et al., 2019). ) для контроля целостности барьера в сложных культурах клеток. Эти примеры подчеркивают потенциал гибких и микроэлектронных методов производства в мониторинге полного формирования барьера в будущих трехмерных моделях тканевой инженерии. Однако, хотя такие измерения, как TEER, очень распространены в 2D-системах, эти измерения еще не получили широкого применения в более крупномасштабных 3D-системах.

В целом, мы обсудили различные механизмы, с помощью которых трубчатые каркасы могут быть построены для тканевой инженерии. Мы разделили доступные производственные методики на пять основных категорий: литье, электропрядение, прокатка, 3D-печать и децеллюляризация. Инновации для каждой из этих методологий по-прежнему создаются сегодня, с постоянным развитием новых достижений в производстве каркасов и систем тканевой инженерии. Такие методы, как 3D-печать и самосборные прокатные каркасы, позволяют одновременно улучшать простоту производства и сложность системы, приводя к созданию систем тканевой инженерии, которые действительно имитируют естественные ткани.По мере разработки этих систем мы скоро увидим их жизнеспособное использование для тестирования безопасности и эффективности лекарств в будущих биомедицинских исследованиях.

Pipe Dreams: 15 полностью трубчатых строительных лесов

Строительные леса обычно помогают предотвратить травмы людей на работе. Если кто-то получил травму во время работы на строительной площадке, он может захотеть обратиться к юристу, чтобы узнать, сможет ли он получить компенсацию за свои травмы. Но иногда строительные леса могут использоваться не только в качестве меры безопасности.Хотя строительные леса обычно выглядят как бельмо на глазу, затмевающее архитектуру и блокирующие тротуары, строительные леса - это больше, чем их основная функция, с их модульной сетью труб, используемой для паразитической архитектуры, временных павильонов, торговых стендов и скульптур. Фактически, переделанные леса практически бесплатны, легко собираются и удивительно универсальны, и их использовали для всего, от превращения заброшенного фонтана в спа-центр до выращивания свежих съедобных растений в центре города.

Монументальная лестница из строительных лесов от MVRDV

Достаточно большая, чтобы к ней могли попасть сразу сотни людей, эта безумно высокая лестница почти полностью сделана из строительных лесов, предлагая посетителям прямой доступ на крышу Groot Handelsgebouw в Роттердаме.Инсталляция, разработанная MVRDV, отражает энергичные усилия по восстановлению города после Второй мировой войны и направлена ​​на поощрение «новой, гораздо более интерактивной, трехмерной и более плотной городской топографии для следующего поколения города». 180 ступенек ведут к временной смотровой площадке и кинотеатру на крыше, которые будут открыты до 12 июня 2016 года.

Bow-House Parasitic Home

В другом примере паразитической архитектуры Bow-House представляет собой каркас строительных лесов, покрытый восстановленными дверями и окнами, расположенный на кирпичной стене без окон в Херлене, Нидерланды.Французский архитектор Стефан Малка построил партизанское сооружение как бесплатное открытое убежище, где может временно жить любой желающий. Основанный на гибкой системе, он может быть адаптирован для любого общественного пространства с пустой стеной и состоит из бесплатных, утилизированных и простых в сборке компонентов.

Pop-Up Urban Spa у заброшенного фонтана

Добавьте строительные леса и палубу из поддонов вокруг заброшенного общественного фонтана, и вы получите веселый городской спа-центр, где дети и их семьи могут спастись от жары Чиуауа, Мексика.Компания PKMN Architectures восстановила почти все материалы, использованные для этого проекта восстановления в парке Уруэта, где центральный фонтан был сломан в течение многих лет. Спроектировать и построить всплывающее творение ушло всего две недели, а окружающие его строительные леса поддерживают гамаки, платформы для отдыха и тканевые шторы.

Резиденция художников под открытым небом

Обыгрывая концепцию резиденции художника для художников-монументалистов и одновременно комментируя доступность доступного жилья в городских районах, эта инсталляция миланского художника Фра.Biancoshock менее чем частный, и в этом суть. «24/7» подчеркивает разницу в условиях работы между уличными художниками и студийными художниками, а также зачастую бедные условия жизни почти всех художников-визуалистов с четырехэтажной резиденцией под открытым небом, построенной из строительных лесов.

Павильон Humanidade 2012

Хотя на мероприятиях нет ничего необычного в использовании строительных лесов для временных сооружений, Pavilion Humanidade превосходит почти все из них по масштабу и сложности.Павильон, созданный для Рио + 20, конференции ООН по устойчивому развитию в Рио-де-Жанейро, получил от архитектора Карлы Хуасабы приз arcVision для женщин в архитектуре в 2012 году. Многослойный и полупрозрачный, он почти полностью построен из ранее использованных строительных лесов и полностью перерабатывается. Он возведен на месте старого форта с видом на пляжи Копакабана и Ипанема.

.

Автор: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

×