Индикаторы напряжения: Страница не найдена – Я

Содержание

Электрические испытательные приборы и приборы для контроля целостности цепей, индикатор напряжения

Talk to a Fluke sales expert

Связаться с Fluke по вопросам обслуживания, технической поддержки и другим вопросам»

Имя *

Фамилия *

Электронная почта *

Компания *

Номер телефона *

Страна * - Select -United States (Estados Unidos)CanadaAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarticaAntigua and BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosБеларусь (Belarus)Belgien/Belgique (Belgium)BelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBonaire, Sint Eustatius and SabaBosnia and HerzegovinaBouvet IslandBotswanaBrasil (Brazil)British Indian Ocean TerritoryBrunei DarussalamBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCape VerdeCayman IslandsCentral African RepublicČeská republika (Czech Republic)ChadChile中国 (China)Christmas IslandCittà Di VaticanCocos (Keeling) IslandsCook IslandsColombiaComorosCongoThe Democratic Republic of CongoCosta RicaCroatiaCyprusCôte D'IvoireDanmark (Denmark)Deutschland (Germany)DjiboutiDominicaEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEspaña (Spain)EstoniaEthiopiaFaroese FøroyarFijiFranceFrench Southern TerritoriesFrench GuianaGabonGambiaGeorgiaGhanaGilbralterGreeceGreenlandGrenadaGuatemalaGuadeloupeGuam (USA)GuineaGuinea-BissauGuyanaHaitiHeard Island and McDonald IslandsHondurasHong KongHungaryIcelandIndiaIndonesiaIraqIrelandIsraelIslas MalvinasItalia (Italy)Jamaica日本 (Japan)JordanKazakhstanKenyaKiribati대한민국 (Korea, Republic of)KuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacaoMacedoniaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMéxico (Mexico)MicronesiaMoldovaMonacoMongoliaMontenegroMonserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNederland (Netherlands)Netherlands AntillesNepalNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorge (Norway)Norfolk IslandNorthern Mariana IslandsOmanÖsterreich (Austria)PakistanPalauPalestinePanamaPapua New GuineaParaguayPerú (Peru)PhilippinesPitcairn IslandPuerto RicoРоссия (Russia)Polska (Poland)Polynesia (French)PortugalQatarRepública Dominicana (Dominican Republic)RéunionRomânia (Romania)RwandaSaint HelenaSaint Pierre and MiquelonSaint Kitts and NevisSaint LuciaSaint Vincent and The GrenadinesSan MarinoSao Tome and PrincipeSaudi ArabiaSchweiz (Switzerland)SenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Georgia and The South Sandwich IslandsSouth SudanSri LankaSudanSuomi (Finland)SurinameSvalbard and Jan MayenSverige (Sweden)SwazilandTaiwanTajikistanTanzaniaThailandTimor-LesteTokelauTogoTongaTrinidad and TobagoTunisiaTürkiye (Turkey)TurkmenistanTurks and Caicos IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited Arab EmiratesUnited KingdomUnited States Minor Outlying IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVirgin Islands (British)Virgin Islands (USA)VenezuelaVietnamWallis and FutunaWestern SaharaWestern SamoaYemenZambiaZimbabwe

Почтовый индекс *

Интересующие приборы

Consent Check

?Отмечая галочкой этот пункт, я даю свое согласие на получение маркетинговых материалов и специальных предложений по электронной почте от Fluke Electronics Corporation, действующей от лица компании Fluke Industrial или ее партнеров в соответствии с политикой конфиденциальности.

Политика конфиденциальности

Leave this field blank

Индикатор напряжения: однополюсная и двухполюсная модификации

В современном мире, на работе и в быту, людей окружают электрические приборы. Однако при отсутствии напряжения в сети или повреждении проводки они становятся бесполезными. Чтобы найти причину неисправности, применяют индикатор напряжения. Этот прибор также используется для проверки состояния электрических сетей и оборудования перед началом ремонтных и монтажных работ.

Виды приборов

Только убедившись в отсутствии разности потенциалов в сети и на токоведущих частях электрических машин, можно безопасно выполнять какие-либо электротехнические работы. Электрооборудование делится на низковольтное (до 1кВ) и высоковольтное (свыше 1кВ). Соответственно индикаторы (указатели) бывают низкого (УНН) и высокого напряжения (УВН).

Индикаторы бывают двух типов:

  • однополюсные;
  • двухполюсные.

Однополюсный пробник

Используется только в цепях переменного тока напряжением до 1кВ. Требуют касания к оборудованию в одной точке. Цепь замыкается через человека на землю. Свечение индикатора вызывает протекающий емкостной ток.

Предназначен для проверки узлов вторичной коммутации. С его помощью можно обнаружить фазу в проводниках или на узлах любого низковольтного электрооборудования, в том числе бытового. Чаще всего применяется при работах с освещением, проверке патронов, выключателей, фразировке электросчётчика.

Самая распространённая конструкция представлена в виде отвёртки или авторучки. Позволяет проверить присутствие или отсутствие фазного напряжения. Корпус изготовлен из прозрачного диэлектрического материала. В нём расположены детали устройства:

  • штырь — отвёртка;
  • газоразрядная лампа — индикатор с порогом зажигания до 90 вольт;
  • резистор номиналом 1Мом, подключенный последовательно, обеспечивает безопасную величину тока (около 0,5мА), достаточную для свечения индикатора;
  • пружина — обеспечивает надёжный контакт между всеми деталями;
  • торцевой контакт для касания пальцем.

Пользоваться таким индикатором просто. Нужно отвёрткой коснуться оголённой части проводника или токоведущей части электрооборудования, а пальцем дотронуться до торцевого контакта. Если в этой точке есть разность потенциалов (фаза), лампа прибора должна засветиться.

Выпускаются такие индикаторы под названиями: ИНО-70, ИН — 90, ИН-91 и другими. Недостатком этих устройств является низкая чувствительность и подверженность наводкам от соседней электропроводки.

Двухполюсные устройства

Может использоваться в работе с переменным и постоянным током. В процессе нужно коснуться к двум точкам оборудования, между которыми может быть разность потенциалов. Неоновая лампа светится при протекании активного тока.

Двухполюсный индикатор напряжения состоит из двух диэлектрических корпусов с электродами — наконечниками. Соединяются корпуса гибким, изолированным, медным проводником длиной 1 м. Содержимое одного из корпусов — неоновая лампа, шунтированная резистором. Дополнительный резистор, ограничивающий ток, может быть в этом же корпусе или другом.

Неоновая лампа светится при появлении тока, вызванного разностью потенциалов между точками касания к электрической установке. Ток величиной несколько миллиампер обеспечивает чёткое свечение — сигнализацию наличия фазового провода.

Примерами таких двухполюсных указателей напряжения могут быть модели УНН-10К, УН-500, ПИН-90М и так далее. Такие устройства более функциональны. В отличие от однополюсных они позволяют проверить целостность нулевого (заземляющего) провода и определить линейное и фазное напряжение:

  1. Указатель УНН-10К может работать в сетях с переменным и постоянным током разностью потенциалов от 110 В до 500 В.
  2. Указатель ПИН-90М. Его конструкция и принцип действия аналогичны предыдущему, но прибор может использоваться в сетях с диапазоном от 50 В до 1000 В.

Указатель высокого напряжения (УВН)

Используется в распределительных устройствах высоковольтного оборудования при выполнении профилактических и ремонтных работ. Даёт возможность обнаружить большую разность потенциалов, проконтролировать фазировку.

Наибольшее распространение получили указатели типа УВН-10 и УВНУ-10. Принцип работы основан на возникновении емкостного тока при внесении рабочей части устройства в электрическое поле оборудования под напряжением. Этот ток возбуждает свечение индикатора.

Конструктивно УВН состоит из трёх основных элементов:

  • рабочая часть;
  • изолирующая часть;
  • рукоятка с ограничивающим кольцом.

Перед работой указатель необходимо собрать. Для этого выкручивают рабочую часть из изолирующей, переворачивают её и ввинчивают обратно. Щуп должен оказаться на месте, противоположном рукоятке.

Выпускается несколько модификаций таких указателей. В рабочей части для контакта с узлом под напряжением может присутствовать электрод-наконечник (УВН-10) или отсутствовать для указателя бесконтактного типа.

Индикаторная часть чаще всего совмещена с рабочей и включает световую или комбинированную (светозвуковую) индикацию (УВНУ-10 СЗ ИП).

Для световой индикации применяют газоразрядные лампы, а в более современных конструкциях — светодиоды. Сигналы, световой и звуковой, должны легко распознаваться.

Изолирующая часть указателя изготавливается из диэлектрика с повышенными диэлектрическими и механическими характеристиками. Должна иметь гладкую поверхность и быть влагостойкой (не поглощать влагу). На ней не должно быть царапин, трещин и расслоений.

Универсальные тестеры

В последнее время получили признание благодаря большей функциональности. Как правило, это двухполюсные указатели. Индикация комбинированная — светозвуковая. Тестеры позволяют оценивать величину разности потенциалов постоянного и переменного тока в пределах от 12 В до 660 В, а также выполнять проверку электрических цепей на обрыв.

Отсутствие обрыва в цепи сигнализируется непрерывным зуммером. В однополюсном режиме можно узнать полярность постоянного тока и определить фазу для переменного тока. Световыми индикаторами в таких устройствах являются светодиоды повышенной яркости. Источники питания — встроенный конденсатор большой ёмкости или миниатюрный литиевый аккумулятор.

Параллельно со световой индикацией работает звуковая сигнализация (пьезоизлучатель звука), что делает работу с ним более безопасной и комфортной. Пример подобных приборов — УННДП-12−660

Правила пользования

Приступая к работе с указателем напряжения, нужно убедиться в его целостности и работоспособности. Разность потенциалов, для которой он предназначен, должна быть выше рабочего напряжения проверяемого электрооборудования. Дата следующего лабораторного испытания указателя не должна быть просрочена.

Перед работой с указателем низкого напряжения (УНН) его нужно проверить на работоспособность. Для проверки можно использовать подключенную розетку напряжением 220 В. Однополюсный индикатор должен определить фазу, а двухполюсный — наличие напряжения 220 В.

Для проверки указателя высокого напряжения (УВН) его щуп приближают к частям электроустановки, на которую подано высокое напряжение. Должна сработать сигнализация. Все операции с УНН нужно делать в диэлектрических перчатках.

Работы на электрооборудовании под напряжением связаны с риском для жизни и здоровья. Указатели относятся к основным средствам электрозащиты и при правильном использовании обеспечат безопасность при работе с электрическими приборами.

Индикаторы напряжения

Универсальный светодиодный индикатор напряжения для линий 0,4-35кВ

Светодиодный индикатор напряжения предназначен для обеспечения световой сигнализации о наличии напряжения в 3-фазных линиях с заземленной нейтралью или наличия опасных напряжений относительно земли в 3-фазных линиях с изолированной нейтралью.

Не требует отдельного питания. Индикатор устанавливается стационарно, полностью автономен и не требует обслуживания.

Индикатор подключается непосредственно к контролируемой линии тремя резистивными балластами малой мощности, обеспечивающими необходимые напряжения изоляции (0,4;6;10..35кВ) и отбираемый ток величиной 0.1мА.

Выпускается в стандартном корпусе для монтажа на DIN рейку. Рабочая частота — 25...5000Гц. Малый ток балласта (0.1мА) обеспечивает не только полную безопасность при работе с индикатором, включая даже его замену без обесточивания и отключения балластов от контролируемой сети, но и практически незаметен для человека, т.к. осязаемый ток при случайном прикосновении к оголенному проводу линии 50Гц составляет 0.5-1.5мА, а опасным считается ток только свыше 10мА. Это позволяет монтировать индикатор не только в изолированном персональном боксе, но и в обычных боксах низкого напряжения вместе с автоматикой.

Индикатор позволяет организовать визуальный контроль за наличием опасных напряжений, что важно для обеспечения безопасности персонала, в т.ч. при обесточивании цепей воздушными размыкателями на ВЛ при обслуживании отдельно стоящих трансформаторов и КТП. Иногда не всегда отчетливо видно фактическое состояние контактов размыкателя, но яркие мигающие светодиоды предупреждают персонал о наличии высокого напряжения на каждой фазе. При правильном размыкании воздушного размыкателя, светодиоды гаснут, что говорит об обесточивании цепи. Мигание одного или нескольких светодиодов свидетельствует о том, что обесточивание не произошло по какой-то причине и безопасная работа невозможна. Яркость светодиодов достаточна для определения опасного напряжения даже в солнечную погоду, что недостижимо для индикаторов на неоновых индикаторах. Индикатору не страшны даже 10-ти кратные перенапряжения на линии, что важно при использовании на ВЛ большой протяженности.

Малые габариты (всего 2DIN) и отсутствие необходимости подводить внешнее питание позволяют закрепить индикатор в небольшом отдельно стоящем герметизированном боксе в удобном для контроля месте, например, рядом с рукояткой размыкателя или непосредственно на обесточиваемом объекте, включая РУНН.

Индикатор содержит встроенные трансформаторные преобразователи ток/напряжение, обеспечивающие устойчивую работу индикации при входных токах от 0,01мА до 0,4мА. Номинальный входной ток индикатора составляет 0.1мА, что позволяет использовать высокоомные резистивные балласты с малой мощностью. Для примера — это 2.2 МОм с рассеиваемой мощностью всего 22мВт на линию 0,4кВ или 35Мом с рассеиваемой мощностью 0,35Вт на линию 6кВ... Нужное сопротивление и рабочее напряжение балласта набираются последовательным соединением резисторов, которые помещаются в герметичный корпус. Балласт имеет гибкие вывода для подключения соответственно к контролируемой линии и индикатору. Балласт обеспечивает требуемую длину путей утечки по ГОСТ 9920-89. Вес балласта незначителен (всего 350гр для линии 10кВ) и имеет легкосъемное крепление на плоские шины при установке в РУ. Потребляемая мощность индикатора ничтожно мала и соизмерима с обычными утечками по изоляторам.

принцип работы и особенности применения

Хозяйственную деятельность любого предприятия и ведение домашнего хозяйства невозможно представить без электричестваэлектрическая энергия необходима для эффективной работы оборудования, техники, крупных и мелких бытовых приборов. проводки часто приводит к появлению разного вида неисправностей. В одном случае произойдет остановка домашних приборов и бытовой техники из за отсутствия напряжения сети. А в другой ситуации может начаться пожар, очагами возгорания которого могут стать искрящиеся выключатели, розетки, удлинители, а также вышедшие со строя источники искусственного освещения. Для решения такого рода проблем с электроснабжением в домах, квартирах, необходимы услуги профессиональных электриков. Они за определенную плату смогут устранить любые неисправности с проводкой и вернуть комфортные условия ведения домашнего хозяйства. Но большинство поломок можно устранить своими руками. Индикатор напряжения, его еще называют индикаторной отверткой или отвертка индикатор, в основном служит для определения, есть ли напряжение на участке сети, или нет. Это обеспечит безопасность во время проведения электроремонтных работ, подключения бытовых приборов, устранения неполадок, обусловленных прекращением подачи электрического тока. С ее помощью определить ноль и фазу в сети не составляет большого труда. Самостоятельное устранение проблем с электроснабжением является рациональным, экономически выгодным решением, позволяющим сэкономить денежные средства на оплату услуг электриков.

Принцип действия индикаторной отвертки

Универсальный и доступный всем слоям населения индикатор напряжения должен быть в арсенале каждого хозяина. Устранение неисправностей электрической проводки с использованием надежных, компактных устройств, идентифицирующих напряжение в сети, позволяет исключить опасность для здоровья и жизни мастера. Устройство индикаторной отвертки отличается простотой и небольшим количеством деталей.

К основным конструктивным элементам устройства, который может показать фазу и ноль, относятся:

  • корпус, состоящий из изолированной рукоятки, стержня, в торце которого размещено жало отвертки;
  • резистор с высоким сопротивлением;
  • индикаторная лампочка;
  • пружина;
  • контактная пластина.

Принцип работы индикаторной отвертки контактного типа основан на прохождении электрического тока через жало после его прикосновения к фазному проводу, резистор и лампочку, вызывая ее свечение, а также последующем его уходе при помощи сенсорного контакта по направлению к земле через тело мастера. Большое сопротивление резистора приводит к получению низкого напряжения. Его величина неощутима и безопасна для здоровья, жизни людей.

Критерии выбора изделий

Зная, как определить фазу и ноль индикаторной отверткой, всегда можно быстро устранить проблемы с электроснабжением своего жилища своими руками. При выборе указателя напряжения рекомендуется учитывать ряд характеристик. В их перечень внесены:

  • размер и форма корпуса;
  • цветовой оттенок и эргономичность рукоятки;
  • функциональность;
  • наличие источника питания для автономной работы отвертки;
  • тип индикаторной лампочки: неоновая или светодиодная;
  • наличие дисплея и звукового сигнала;
  • компания — производитель;
  • стоимость изделия.

Оптимальный выбор индикатора напряжения обуславливает успешное использование изделий и абсолютную безопасность проведения ремонтных работ.

Разновидности индикаторных отверток и их особенности

Индикаторы напряжения представлены широким ассортиментом моделей, благодаря которым профессиональные и домашние мастера могут приобрести надежные, универсальные приборы в соответствии со своими предпочтениями, пожеланиями и финансовыми возможностями. К наиболее распространенным их видам относятся следующие модели:

  1. Пробник напряжения с неоновой лампой относится к простой модели отвертки индикатора контактного типа. Работа прибора основана на его свечении после попадания электрического тока на жало устройства с поверхности проводника и последующего его прохождения через резистор сопротивления. Вторым контактом в цепи включения неоновой лампочки является торцевая часть рукоятки. Его замыкание происходит на человеке. Свечение неоновой лампы после нажатия пальцем торцевой части ручки индикатора указывает на наличие фазы на контакте розетки, выключателя, бытового прибора или другого источника питания, подлежащего ремонту. Контакт с мастером обеспечивает включение индикаторной лампы. Высокий порог индикации напряжения, составляющий от 60В, относится к недостаткам отверток. Они рекомендованы для определения фазы электрической цепи переменного тока. С их помощью мастер не сможет обнаружить обрывы электрических цепей.
  2. Индикаторный тестер со светодиодной лампой отличается низким порогом индикации напряжения. Его идентификация в электрической цепи происходит при значениях, менее 60В. Работа устройства не имеет существенных отличий от функционирования аналогов с неоновыми лампами.
  3. Индикаторная отвертка со светодиодом и батарейками относится к категории бесконтактных многофункциональных приборов. Пробник напряжения такого вида дополнен биполярным транзистором и рекомендован для определения фазного провода, мест обрыва электрической цепи, полярности источников постоянного тока. Тестер со светодиодом и батарейками предоставляет возможность находить месторасположение проводки в стенах помещений под слоем отделочного покрытия.
  4. Пробник электронного вида с дисплеем и звуковым сигналом относятся к современным моделям указателей напряжения. Работа с компактным устройством не вызывает трудностей. При появлении вопросов по использованию электронной модели отвертки на помощь придет инструкция от производителя. Она входит в комплектацию многофункционального индикатора напряжения.

Использование электронной отвертки не имеет отличий от применения других аналогов отверток, предназначенных для проведения безопасного ремонта электрических сетей, приборов, оборудования. Практическое определение напряжения, мест неисправностей розеток, выключателей и других источников питания при помощи многофункционального прибора всегда можно увидеть на видео в интернете. Владея информацией о том, как пользоваться индикаторной отверткой, всегда можно избежать электрических ударов, воздействие которых представляет опасность для здоровья и жизни человека.

Использование указателей напряжения

Применение отверток индикаторов предоставляет возможность найти фазный провод, ноль и землю в розетках, выключателях, осветительных приборах, убедиться в наличии напряжения в электрической сети, выявить пробои напряжения на корпус бытовой техники, а также обнаружить проводку в стенах под плиткой или слоем штукатурки с финишным отделочным покрытием. Работа с тестерами начинается после их проверки. Испытание выполняется на участке с напряжением. О его наличии в сети укажет световой сигнал неоновой или светодиодной индикаторной лампы. После проверки пригодности прибора осуществляется устранение поломок и неисправностей электрических сетей, бытовой техники, осветительных приборов. К основным видам работ с применением тестеров напряжения, относятся:

  1. Поиск фазы и ноля необходим при отсутствии маркировки электрических проводов. Работа начинается с отключения автомата на вводном щитке, от которого происходит питание электросети на месте проверки. После зачистки проверяемых проводов и последующего разведения их друг от друга на безопасное расстояние, исключающее возможность короткого замыкания или поражение человека электрическим током, приступают к идентификации фазного кабеля. Если после включения электрического тока и прикосновения индикатора напряжения к зачищенному концу провода будет гореть лампа, то этот проводник является фазным. Второй провод — это нуль. В случае, если индикаторная лампа не горит, то, значит, первый проводник без напряжения. Второй провод можно считать фазой, в чем обязательно надо убедится с помощью индикатора.
  2. Определение утечки напряжения на корпус электрического прибора предусматривает простое прикосновение жала индикаторной отвертки к металлической (неокрашенной) его части. Появление светящейся лампы на индикаторе после включения бытовой техники в сеть указывает на наличие фазы на корпусе прибора, а также необходимость срочного устранения этой проблемы. Яркое свечение индикаторной отвертки свидетельствует о прямом контакте фазной жилы кабеля с корпусом электроприбора, прикосновение к которому может стать причиной поражения электрическим током.
  3. Проверка качества проводимости цепи осуществляется путем прикосновения зачищенных от изоляции концов провода к жалу и пальцевому контакту индикатора. Звуковой сигнал или светящаяся лампа показывает на отсутствие проблем с целостностью проводника.
  4. Выявление скрытой проводки в стенах основано на появлении светового или звукового сигнала индикатора напряжения в зоне электромагнитного поля, создаваемого кабелем, подключенным к питанию сети. Его границы будут определяться путем медленного передвижения индикаторной отвертки по стене в разных направлениях.Срабатывание звукового или светового сигнала указывает на месторасположение токопроводящей проводки под слоем штукатурки, финишного отделочного покрытия.
  5. Нахождение обрыва проводов основано на прекращении функционирования отверток индикаторов. В местах повреждения пробник напряжения не будет светиться, издавать звуковые сигналы. Его работа будет остановлена.
    Применение индикаторных отверток является обязательным условием при проведении ремонтных работ, связанных с напряжением. Правильное их использование является залогом безопасности, исключающим риск поражения электрическим током.

Индикатор напряжения: виды, функции, применение

В каждом доме имеется определенный набор инструментов, с помощью которых можно решать неотложные задачи по ремонту бытовой техники, электропроводки, осветительных приборов и других объектов. Среди них следует особо отметить индикатор напряжения, позволяющий точно установить наличие или отсутствие электричества на том или ином участке. Этот прибор становится актуальным при внезапном исчезновении света, поскольку именно индикатор напряжения используется во время первичных мероприятий.

Классификация указателей напряжения

Индикаторы или указатели напряжения, применяемые в бытовых условиях, представляют собой компактные переносные устройства. Сюда же входит и мультиметр. Их основная функция заключается в определении наличия или отсутствия разности потенциалов на участках токоведущих элементов и частей. Все они оборудованы световыми сигналами – индикаторами, которые загораются в случае обнаружения напряжения на проверяемом участке и рассчитаны на разный вольтаж.

Индикаторы разделяются на устройства замеров напряжения до 1000 В и свыше 1000 вольт. Конструктивно они бывают одно- или двухполюсными.

Однополюсный индикатор напряжения касается только одной токоведущей части. Замыкание на землю происходит непосредственно сквозь человеческое тело при замыкании пальцем специального контакта указателя. Электрический ток, протекающий в этот момент, составляет не более 30 мА и совершенно безопасен для человека.

Данные индикаторы изготавливаются в виде отверток или авторучек. Все конструктивные элементы размещаются в диэлектрическом корпусе со смотровым отверстием. В первую очередь, это сам индикатор и резистор. Вверху расположен металлический контакт для касания, а снизу – щуп, соприкасающийся с токоведущими частями. С помощью этих приборов совершаются: определяется фаза и ноль, наличие напряжения на контактах автоматов и других предохранительных устройств.

Значительно больше функций у двухполюсных индикаторов напряжения. При совершении проверочных действий соприкосновение прибора происходит сразу с двумя точками участка или электроустановки. В результате, по устройству начинает протекать электрический ток и загорается индикаторная лампочка, мощностью не выше 10 Вт. Она потребляет очень малое количество тока, что совершенно не влияет на четкость и устойчивость сигнала. В качестве ограничителя тока в цепи устанавливается резистор, соединяемый последовательно с лампой.

Двухполюсный указатель используется при диагностике оборудования постоянного и переменного тока. Приборы этого типа могут выполнять более широкий диапазон мероприятий по сравнению с обычными индикаторами.

Пассивная отвертка – индикатор напряжения

Единственной функцией такого индикатора является определение напряжения на участке электропроводки или контактах оборудования. Стандартный указатель состоит из двух рабочих частей. Одна из них представляет собой плоскую отвертку, осуществляющую непосредственный контакт с деталями, находящимися под напряжением. Вторая часть вмонтирована в ручку отвертки и создает необходимое сопротивление.

Понять как пользоваться индикатором, можно на примере обычной электрической розетки, к которой подключены фазный и нулевой проводники. Чтобы определить принадлежность, нужно зажать большим пальцем контакт, находящийся вверху рукоятки. После этого по очереди нужно коснуться рабочей частью отвертки контактов розетки. На одном из них присутствует напряжение, о чем сразу же просигнализирует индикатор, загораясь внутри отвертки оранжевым или красным светом. На прикосновение к нулевому проводу никакой реакции не последует.

Положительными качествами такого индикатора являются следующие:

  • Работа прибора осуществляется непосредственно от фазы и не требует дополнительных источников питания.
  • Простая конструкция обеспечивает высокую точность показаний.
  • Возможность функционирования в широком температурном диапазоне.
  • Не требует специальных знаний и навыков при использовании. Пользоваться индикаторной отверткой очень просто. При необходимости может применяться как обычная плоская отвертка.
  • Срок эксплуатации практически не ограничен.

К минусам можно отнести необходимость снятия защитных перчаток во время работы с прибором, а также слабое свечение лампочки, плохо различимое при солнечной погоде. В целом же индикатор наличия напряжения идеально подходит для тестирования внутри помещений.

Индикаторная отвертка с расширенными функциями

Данное устройство также оборудовано световой индикацией и может использоваться в контактном и бесконтактном вариантах. Оба метода позволяют установить наличие или отсутствие обычного или низкого напряжения на проверяемом участке. Кроме того, прибор дает возможность проверить состояние цепи и ее отдельных элементов – предохранителей, кабелей и проводов.

Указатель разделяется на две основных составляющих. Одна из них выполнена в виде плоской отвертки, непосредственно контактирующей с проверяемыми элементами. С помощью второй детали осуществляется бесконтактная проверка напряжения. Обе части, дополняя друг друга, позволяют определить целостность электрической цепи.

Светодиодный электронный индикатор расположен в рукоятке, изготовленной из прозрачного диэлектрического материала. При наличии фазы подается световой сигнал. Здесь же размещаются и батарейки, которые служат источником питания.

Определение фазы и нуля осуществляется по такой же схеме, как и с обычной индикаторной отверткой. То есть жало инструмента поочередно касается контактов. Наличие фазного провода подтверждается загоревшимся индикатором. Бесконтактная проверка выполняется с помощью верхней рабочей части. В этом случае инструмент необходимо правильно удерживать в руке за середину рукоятки и не касаться, при этом, нижней рабочей части. Несоблюдение этого правила приведет к переходу в режим прозвонки и сигнал о наличии фазного провода будет ложным.

Верхняя часть индикаторной отвертки подносится к изоляционному покрытию проводника, не касаясь его поверхности. Наличие фазы начнет определяться в момент приближения указателя к проверяемому участку, а индикатор подаст световой сигнал. Целостность проводников определяется путем прозвонки. Данная операция выполняется при полном отсутствии напряжения в сети.

Сама проверка выполняется в следующем порядке:

  • Защитные перчатки нужно снять и пальцем одной руки зажать верхнюю рабочую часть устройства.
  • Жалом индикатора коснуться жилы провода на одном из концов. Другой рукой нужно дотронуться до второго конца проводника.
  • Срабатывание индикаторной лампочки указывает на целостность проверяемой жилы. Если же пробник не сработал, следовательно у жилы имеется повреждение, скорее всего полный обрыв. Данный способ может использоваться не только в отношении проводов, но и предохранителей.

Несомненными плюсами подобных индикаторов является хорошо различимая световая сигнализация, возможность определения напряжения контактным и бесконтактным способами. Можно прозвонить цепь и проверить ее целостность, а сам указатель использовать как обычную плоскую отвертку. Незначительные минусы связаны с регулярной заменой батареек и ограниченным температурным диапазоном в пределах от минус 10 до плюс 50 градусов.

В целом устройство считается простым и надежным и вполне может использоваться не только в быту, но и в профессиональной деятельности.

Цифровой индикаторный указатель с расширенными функциями

В указателях этого типа отсутствуют какие-либо источники питания. Примерно по середине корпуса расположен жидкокристаллический дисплей в форме прямоугольного окошка. На этом экране высвечивается установленный цифровой ряд значений напряжения – 12, 36, 55, 110 и 220 В.

Цифровой индикатор напряжения оборудован двумя полюсными кнопками. Одна из них используется при бесконтактных измерениях, другая – при контактных. Рабочая часть выполнена в стандартном варианте и представляет собой плоскую отвертку.

Результаты тестирование цифрового индикатора проводимые на отключенном автоматическом выключателе

По результатам проверки работоспособности было выявлено следующее:

  • Вначале рабочая часть соприкоснулась с нулевым контактом. На экране высветился незначительный показатель напряжения, хотя такое возможно только при включенной нагрузке. В данном случае дисплей должен был оставаться чистым.
  • При контакте с фазным проводом тестер выдал два значения. Первое в количестве 110 вольт отобразилось четко, а второе – 220 В было едва различимо на экране, хотя оно как раз и является реальным показателем.
  • Заявленный бесконтактный режим не сработал, хотя без нажатия соответствующей кнопки на экране отобразился плохо видимый значок в виде молнии. Таким образом, напряжение все-таки удалось определить бесконтактным способом, не отраженным в паспорте изделия.

Несмотря на большое количество заявленных функций, в целом указатель проявил себя, как не вполне надежный в эксплуатации. Полученные значения отображаются лишь приблизительно, а бесконтактный способ практически не работает. Возможно все дело в отсутствии собственных источников питания, которые могли бы поддерживать на должном уровне работоспособность устройства. К недостаткам также можно отнести ограниченный температурный диапазон и верхний предел измеряемого напряжения, составляющего 250 В.

Индикатор со звуковыми сигналами

Данная модификация индикатора напряжения, помимо вышеперечисленных функций, оборудована звуковой сигнализацией. За счет этого существенно повышается электробезопасность при выполнении проверочных мероприятий.

Звуковой сигнал подается только в бесконтактном режиме в случае обнаружения напряжения. Одновременно загорается зеленая лампочка светового индикатора. При работе устройства в контактном режиме звук не подается, а обозначается лишь индикацией красного цвета. Следовательно, в приборе установлены две разноцветные сигнальные лампочки.

Звуковые сигналы подаются через динамик, установленный в верхней части индикатора. Неподалеку от него в торце располагается переключатель, изменяющий рабочие режимы. Он может устанавливаться в следующие положения:

  • Позиция «О». Включает контактное световое оповещение. Напряжение возможно определить лишь напрямую контактируя с фазой.
  • Позиция «L». Активирует среднюю чувствительность при бесконтактном звуковом оповещении. Сопровождается индикацией зеленого цвета. Напряжение определяется с небольших расстояний, даже, если проводники покрыты двойной изоляцией. Такая позиция превращает прибор в бесконтактный индикатор напряжения.
  • Позиция «Н». Приводит в действие максимальную чувствительность бесконтактного звукового оповещения. Напряжение в этом случае возможно определить даже с больших расстояний через изоляционный слой. При положительном результате загорается зеленая лампочка.

Рабочее жало индикатора представляет собой плоскую отвертку, защищаемую колпачком. В торце прибора имеется контакт, с помощью которого выполняется прозвонка, то есть определяется целостность участка цепи. Если включен бесконтактный режим максимальной чувствительности защитный колпачок можно не снимать.

В целом, в ходе проверок, указатель зарекомендовал себя как надежный и качественный прибор. Световая и звуковая индикация дублируют друг друга. Определенным минусом является быстрая разрядка батареек, в связи с чем прибор приходится проверять на работоспособность перед каждым использованием.

Особенности двухполюсного индикатора

Двухполюсный или двухконтактный индикатор напряжения относится к категории профессиональных устройств. Функционально он существенно отличается от однополюсного прибора, поскольку не может определить наличие фазы и нуля в проводниках или контактах устройств. Двухполюсные индикаторы способны лишь в целом установить, имеется ли в данной сети напряжение, или нет.

В конструкцию входят два щупа, на концах у которых находятся заостренные штыри, являющиеся рабочими частями. Соединение их между собой с помощью гибкого медного провода.

Основная часть прибора оборудована экраном, отображающим измеряемое напряжение по установленной шкале значений. Индикатор может применяться и в сетях на 380 В. Данное устройство устанавливает не только точное значение напряжения, но и выявляет наличие пониженного напряжения и перенапряжений в сетях 220 В.

Проверка осуществляется через два контакта – фазу-ноль или фазу-землю. Один щуп касается фазы, а другой – нуля или заземления. При наличии напряжения на дисплее отобразятся данные, равные напряжению электрической сети. Если указатель покажет 220 В, это и будет реальным напряжением на данный момент. В бытовых условиях его использование ограничено, поскольку отсутствует возможность определения фазы и нуля. В дополнение к этому прибору потребуется обычная индикаторная отвертка.

ОВЕН Цифровые индикаторы напряжения и тока

Цифровые индикаторы МТ22 выполнены в компактном корпусе для установки в отверстие 22 мм, применяются для отображения действующих значений напряжения и тока. Используются в качестве альтернативы светосигнальным лампам 22 мм при контроле питания и нагрузки в шкафах автоматики или распределительных шкафах. 

Преимущества: 

  • Широкий диапазон напряжения питания 20…500 В АС.
  • Монтаж в отверстие 22 мм.
  • 5 цветов индикации.
  • Размер символа 11 мм.
  • Трансформатор тока до 100 А в комплекте
  • Срок службы 30 000 часов. 

Индикаторы не являются средствами измерения и не подлежат периодической поверке.

Модификации индикаторов напряжения

MT22-VM1

Белый

20-500

MT22-VM3

Зеленый

20-500

MT22-VM4

Красный

20-500

MT22-VM5

Желтый

20-500

MT22-VM6

Синий

20-500

Модификации индикаторов напряжения и тока 

MT22-VAM3

Зеленый

50-500

0-100

MT22-VAM4

Красный

50-500

0-100

MT22-VAM5

Желтый

50-500

0-100

границ | Стратегии оптимизации разработки индикаторов напряжения с генетической кодировкой

Введение

Понять мозг - значит понять, как отдельные нейроны обрабатывают информацию - от кончиков дендритов до сомы и далее до нервных окончаний. Однако настоящая проблема состоит в том, чтобы расшифровать обработку информации в каждом нейроне в контексте его соседей или, другими словами, неповрежденных нейронных цепей, потому что взаимодействия нейронов формируют основу чувственного восприятия, поведения и сознания.

У млекопитающих нейронные ансамбли, состоящие из тысяч нейронов, часто участвуют в сложном процессе, таком как реконструкция визуальной сцены или маневрирование в локальной среде. Чтобы декодировать обработку информации во время такого поведения, становится необходимым получить одновременные электрические записи паттернов активности ввода-вывода от всех участвующих нейронов с разрешением одной клетки.

Традиционная электрофизиология основана на использовании накладных электродов (внутриклеточных) и многоэлектродных решеток (MEA) (внеклеточных) для измерения электрических событий, сопровождающих обработку нейрональных сигналов.Патч-электроды могут измерять как подпороговые синаптические потенциалы, так и потенциалы действия (AP), но могут регистрировать только несколько нейронов за раз. С другой стороны, MEA состоят из сотен электрических контактов и могут использоваться для получения записей напряжения от нескольких сотен нейронов одновременно. Современные внеклеточные зонды позволяют использовать почти тысячу плотно расположенных отдельных участков записи, обеспечивая высокое пространственное разрешение для электрических измерений (Jun et al., 2017).Однако разобрать сигналы от отдельных нейронов непросто, так как большинство сайтов отбирают сигналы от нескольких нейронов. Кроме того, этот метод не позволяет проводить целевые записи в определенных клетках, типах клеток или субклеточных компартментах (Buzsaki, 2004; Spira and Hai, 2013).

Ограничения электродных методов были в значительной степени смягчены оптическими подходами к мониторингу нейронной активности, такими как использование синтетических красителей и генетически закодированных флуоресцентных индикаторов.Используя последнее, теперь можно одновременно однозначно регистрировать до 500 нейронов в трехмерном пространстве у бодрствующих и ведущих себя животных, сохраняя при этом клеточное разрешение с помощью методов многофотонного лазерного сканирования (Huber et al., 2012; Katona et al. ., 2012). Генетически закодированные индикаторы могут быть сконструированы для избирательного нацеливания на отдельные типы клеток и субклеточные компартменты и для этого на определенных стадиях развития. Генетически закодированные индикаторы кальция и напряжения [GECI и генетически закодированные индикаторы напряжения (GEVI), соответственно] позволяют визуализировать активность меченых нейронов в продольном направлении (Denk et al., 1996; Майнен и др., 1999; Мао и др., 2008; Тиан и др., 2009; Mittmann et al., 2011; Чен и др., 2012; Wachowiak et al., 2013; Дана и др., 2014; Ротермель и Вачовяк, 2014 г .; Чжу и др., 2014; Lur et al., 2016), и являются методом выбора для функциональной визуализации в субклеточных компартментах, например, дендритных шипов, недоступных для электродов, и организмов, менее подходящих для экспериментов с зажимом патч-зажим, таких как Drosophila и Caenorhabditis elegans (Tian et al., 2009; Akerboom et al., 2012; Йошихара, 2012; Ковачевич и др., 2013).

Сравнение датчиков кальция и напряжения с генетической кодировкой

С момента разработки в конце 1990-х годов индикаторы флуоресцентной активности значительно улучшились по чувствительности и кинетике (Miyawaki et al., 1997; Romoser et al., 1997; Gong et al., 2015; Chamberland et al., 2017; Kannan). et al., 2018; Piatkevich et al., 2018) и начинают дополнять исследования на основе электродов для понимания фундаментальных аспектов нейрофизиологии.

Кальциевые индикаторы представляют собой молекулярные слияния сенсора кальция, такого как кальмодулин или тропонин С, и флуоресцентного репортерного белка (FP). GECI представляют собой цитозольные белки, которые при связывании внутриклеточного Ca 2+ претерпевают конформационные изменения, которые модулируют выход флуоресценции FP. В некоторых случаях конформационное изменение в кальций-связывающем домене модулирует вместо этого резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) между парой донорных и акцепторных флуорофоров.Современные GECI включают GCaMPs и RCaMPs, GECOs и Cameleons (Nagai et al., 2004; Palmer et al., 2006; Tian et al., 2009; Zhao et al., 2011; Akerboom et al., 2013; Chen et al., др., 2013). Поскольку они обнаруживают внутриклеточный Ca 2+ , уровни которого колеблются во время AP, GECI обеспечивают косвенную оценку надпороговой нейрональной активности.

Напротив, GEVI представляют собой флуоресцентные трансмембранные белки, которые могут непосредственно воспринимать колебания напряжения на мембране во время активности и синаптической передачи.Вольт-чувствительный домен (VSD) в GEVI может происходить из трансмембранных белков, таких как ионные каналы, потенциал-чувствительные фосфатазы или микробные опсины, и слит с одним FP или парой FRET-FP (Jin et al., 2012; Gong et al., 2013, 2014; Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al. , 2016). Зонды на основе опсина также могут функционировать как автономные GEVI, которые сообщают об активности благодаря своей нативной, хотя и тусклой флуоресценции (Gong et al., 2013; Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014).

Генетически закодированные индикаторы напряжения демонстрируют зависимое от напряжения изменение флуоресценции посредством одного из двух различных механизмов: (1) за счет конформационного изменения в датчике напряжения или (2) за счет взаимодействия с переходами активного состояния во время фотоцикла пигмента сетчатки, хромофора в чувствительных к напряжению опсинах. GEVI, подпадающие под категорию 1-го типа, включают ArcLight, VSFP, ASAP1 / 2, Bongwoori и FlicR1 (Димитров и др., 2007; Akemann et al., 2012; Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Пиао и др., 2015; Abdelfattah et al., 2016), тогда как в категорию 2 типа входят производные Archaerhodopsin (Arch), такие как QuasArs, Archers, Archons и индикаторы FRET-опсина, а именно QuasArmOrange2, MacQ-mCitrine, и Ace2N-mNeon, среди прочих (Flytzanis et al., 2014; Gong et al., 2014, 2015; Hochbaum et al., 2014; Zou et al., 2014; Piatkevich et al., 2018). Различные шаблоны GEVI показаны на рисунке 1.

Рис. 1. Рисунок, показывающий различные конструкции GEVI. (A) Большинство GEVI типа 1 состоят из молекулярного слияния изолированного VSD, полученного из чувствительной к напряжению фосфатазы, и одного FP или пары FRET FP. В конструкциях FRET FP могут быть слиты в тандеме или с любым концом VSD. CFP, голубой флуоресцентный белок; YFP, желтый флуоресцентный белок. (B) GEVI типа 2 включают автономные микробные опсины, которые имеют семь трансмембранных спиралей (Th2-TH7), или конструкции опсин-FRET, где опсин может быть слит с флуорофором.Микробные опсины демонстрируют широкий спектр поглощения (500–700 нм) и служат для «гашения» флуоресценции присоединенного флуорофора во время колебаний напряжения.

Как датчики мембранного потенциала, GEVI не ограничиваются обнаружением AP, в отличие от индикаторов кальция, но могут также сообщать о гиперполяризациях, подпороговых деполяризациях, таких как те, которые связаны с синаптической передачей, и устойчивые деполяризации, которые представляют переходные активированные состояния. Кроме того, в то время как индикаторы кальция демонстрируют медленную кинетику (~ 50–75 мс для быстрого GECI GCaMP6f) и могут разрешать всплески только при 20 Гц или ниже (Chen et al., 2013), GEVI могут обеспечить превосходное временное разрешение, способное обнаруживать всплески на частотах более 100 Гц (Gong et al., 2015).

Инновация индикатора напряжения с генетической кодировкой

Из-за их характерной субклеточной локализации и механизма действия критерии для разработки индикаторов напряжения по своей сути отличаются от индикаторов кальция, что порождает уникальные проблемы при их проектировании, разработке и тестировании.

Для индикаторов напряжения

требуются надежные сигналы трафика для обеспечения адекватной и эксклюзивной экспрессии мембраны, что является предпосылкой для высоких отношений сигнал / шум (SNR) в оптических записях - отношения пика оптического отклика к стандартному отклонению базовой флуоресценции ( F 0 ).Точное субклеточное нацеливание особенно важно для индикаторов напряжения, потому что полезные сигналы напряжения возникают, но из ограниченной области клетки (мембраны) по сравнению с большим объемом цитоплазмы, доступной для обнаружения кальция.

Аналогичным образом, повышение чувствительности индикаторов напряжения является особенно сложной задачей. Чувствительность зонда на единицу изменения напряжения выражается как доля изменения флуоресценции (Δ F ) по отношению к базовой флуоресценции. Индикаторы кальция проявляют большую чувствительность, поскольку медленная кинетика последовательных переходных процессов кальция позволяет кумулятивному увеличению амплитуд флуоресцентного отклика.Спайковые переходные процессы кальция имеют короткое время нарастания, но длительное затухание. Быстрые поезда AP заставляют отдельные переходные процессы суммироваться или, другими словами, накладываться друг на друга (Smetters et al., 1999). Таким образом, во время высокочастотных всплесков AP (> ∼20 Гц) GECI связывают накопленный кальций в течение нескольких сотен миллисекунд, намного после того, как лежащие в основе спайки затухают, что приводит к длительным ответам с большим Δ F / F 0 значений. В самом деле, точная кинетика (скорость включения и выключения) и динамический диапазон чувствительности индикатора зависят от его эффективной концентрации, аффинности связывания Ca 2+ и свойств клеточной буферизации кальция.Тем не менее, варианты GCaMP демонстрируют фракционные изменения флуоресценции до 500% для серии из 10 AP и 1000-1700% для 160 AP в культивируемых нейронах, тогда как на самом деле их значения Δ F / F 0 для одиночных AP. составляют всего 10–30% (Tian et al., 2009; Chen et al., 2013). Их высокая чувствительность in vitro и дополнительно делает кальциевые зонды подходящими для экспериментов in vivo , где они обеспечивают высокие отношения сигнал / шум на фоне флуоресценции и ослабления сигнала в толстой ткани.С другой стороны, потоки напряжения очень быстрые - нейронная AP работает менее нескольких миллисекунд. Таким образом, чувствительность GEVI измеряется как Δ F / F 0 для одной точки доступа. Современные GEVI имеют умеренную чувствительность 40–80% Δ F / F 0 в культивируемых клетках для деполяризации 100 мВ (амплитуда ≈AP) (Jin et al., 2012; Hochbaum et al., 2014; Piao et al. др., 2015; Ян и др., 2016; Пяткевич и др., 2018). Ответы дополнительно подавляются in vivo из-за фоновой флуоресценции и светорассеяния.Чтобы увеличить размеры сигнала, по крайней мере, на порядок, становится неизбежным начало высокопроизводительных инженерных и тестовых работ.

Как прямые датчики мембранного потенциала, GEVI могут быть настроены так, чтобы они были чувствительны к гиперполяризации. Однако диапазон напряжений, в котором простирается чувствительность пробника, варьируется. Во многих случаях его можно сместить в сторону более отрицательных потенциалов путем проведения специфических мутаций в ДМЖП (Димитров и др., 2007; Бейкер и др., 2012; Пиао и др., 2015). Полная оптимизация зависимости оптических характеристик от напряжения требует тщательного рассмотрения экспериментальных потребностей и соответствующей разработки датчика напряжения.

В следующих разделах мы рассмотрим характеристики идеального GEVI и текущее состояние датчиков.

Локализация мембраны

Чтобы сообщать об изменениях потенциала клеточной мембраны, индикаторы напряжения должны находиться в плазматической мембране. Они извлекают выгоду из аппарата клеточного транспорта секреторных белков, который транспортируется сюда (Lippincott-Schwartz et al., 2000). Секреторные белки, которые синтезируются и собираются в эндоплазматическом ретикулуме (ER), экспортируются в комплекс Гольджи, где они подвергаются созреванию. В конечном итоге они упаковываются в везикулы пост-Гольджи и перемещаются по микротрубочкам - тонким цилиндрическим структурам, которые составляют каркас клетки. Иногда неправильно свернутые белки и белки, которые прочно связывают шапероны (помощники сворачивания белков), могут быть захвачены ER или комплексом Гольджи, что приводит к внутриклеточным агрегатам.Способствуя нечувствительной к напряжению фоновой флуоресценции, эти агрегаты могут ослаблять отношение сигнал / шум сигналов напряжения в оптических записях.

GEVI первого поколения FlaSh и его производные Flare, VSFP1 и SPARC, представляли собой тандемное слияние потенциалзависимого калиевого или натриевого канала и одной пары FP или FRET-FP (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al. ., 2001; Ataka, Pieribone, 2002; Baker et al., 2007). Эти GEVI проявляли интенсивную внутриклеточную агрегацию в культивируемых клетках эмбриональной почки человека (HEK) и нейронах гиппокампа с менее 5% флуоресценции на плазматической мембране.Внутриклеточная флуоресценция часто обнаруживает «паутинообразный» паттерн, классический фенотип, указывающий на удержание ER (Baker et al., 2007) (Figure 2). Вероятно, из-за их плохой мембранной локализации, эти ранние зонды проявляли чрезвычайно низкую чувствительность к напряжению в нейронах как in vitro , так и in vivo .

Рисунок 2. Конфокальные изображения экспрессии GEVI в диссоциированных нейронах гиппокампа. (A – C) GEVI на основе ионных каналов SPARC, VSFP-1 и Flare обнаруживают плохую мембранную локализацию и «паутинообразные» внутриклеточные агрегаты, что указывает на удержание белка в ER. (D, E) Датчики напряжения на основе VSD Arclight и ASAP1 демонстрируют превосходную мембранную экспрессию, которая хорошо видна даже в субклеточных компартментах, таких как дендриты (вставки). Масштабные полосы = 10 мкм (Baker et al., 2007; Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014).

Чтобы преодолеть проблему агрегации, которая, как считалось, возникала из-за неправильного сворачивания мультимерных или модульных канальных белков, неуклюжие ионные каналы GEVI первого поколения были заменены автономными мономерными VSD трансмембранной фосфатазы, выделенной из морской брызг Ciona Кишечник (сокр. Ci VSD) (Димитров и др., 2007) (Рисунок 2). Ci VSD представляет собой четырехпроходный трансмембранный белок (S1 – S4 α спирали), который может независимо функционировать как датчик напряжения (Murata et al., 2005).

Впоследствии ортологи других видов, таких как курица, данио, мышь, человек и лягушка, были клонированы каждый вместо Ci VSD в качестве предполагаемых датчиков напряжения. Полученные в результате зонды демонстрируют отличные характеристики с VSD курицы (сокр. Gg VSD) и VSD рыбок данио (сокр. Dr VSD), оказывая сильное влияние на кинетику GEVI (Baker et al., 2012; Han et al., 2013; St-Pierre et al., 2014).

Большинство GEVI на основе VSD - VSFP2, VSFP-Butterfly, Mermaid, ArcLight, Bongwoori и FlicR1 - содержат Ci VSD в качестве датчика напряжения, соединенного с зеленым или красным FP или парой FRET-FP (Димитров и др. ., 2007; Tsutsui et al., 2008; Akemann et al., 2012; Jin et al., 2012; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al., 2016). Когда пара FP или FRET сливается с любым внутриклеточным концом VSD (S1 или S4), GEVI демонстрируют преобладающую мембранную локализацию в ненейрональных культурах и культурах гиппокампа.Мембранная локализация, по-видимому, нарушается, когда FP вставляется во внеклеточную петлю между доменами S3 и S4. Однако это не относится к аналогичной вставке FP в Gg VSD в быстродействующем датчике напряжения ASAP1 (St-Pierre et al., 2014).

Индикаторы на основе опсина

также страдали от внутриклеточной агрегации в культивируемых нейронах и срезах мозга, что подтверждает необходимость в алгоритмах взвешивания пикселей для количественной оценки флуоресцентной реакции. Эти алгоритмы выборочно усредняют изменения флуоресценции по пикселям, которые являются информативными (мембранными), при этом не акцентируя внимания на вкладе нечувствительного к напряжению фона (Hochbaum et al., 2014).

Помимо датчика напряжения, выбор FP в слитых белках, нацеленных на мембрану, также влияет на мембранную экспрессию. Красные FP, такие как dsRED, mCherry и mOrange от грибного анемона Discosoma (класс Anthozoa), имеют большую тенденцию к агрегации, тогда как FP, выделенные из медузы Aequorea victoria , такие как широко используемый зеленый флуоресцентный белок (GFP ) и его производные, как правило, лучше передаются (Arrenberg et al., 2009; Gong et al., 2014). Циклические пермутированные (cp) FP, в которых N- и C-концевые фрагменты транспонированы, чтобы сделать их более восприимчивыми к регуляции конформационными изменениями, обычно сложнее складывать, а датчики напряжения, содержащие cpFP, имеют большую склонность к агрегации ( Barnett et al., 2012; Abdelfattah et al., 2016).

Было показано, что добавление пептидных сигналов экспорта ER (FCYENEV) и мембранного транспорта (KSRITSEGEYIPLDQIDINV) от внутреннего выпрямляющего калиевого канала K ir ​​ 2.1 к С-концу микробных опсинов снижает внутриклеточные агрегаты и улучшает экспрессию мембран в клетках млекопитающих (Градинару и др., 2008, 2010). Соответственно, новые GEVI сконструированы для включения этих пептидов в качестве тегов слияния (Gong et al., 2014).

Наконец, при превышении показателей напряжения важно тщательно оценивать любые неблагоприятные воздействия на свойства мембраны. Поскольку GEVI вводят носители заряда в мембрану, их экспрессия, вероятно, влияет на емкость мембраны - меру заряда, накопленного через мембрану, - что, в свою очередь, может влиять на последующие физиологические процессы. Сообщается, что емкостные эффекты GEVI минимальны при обычно достигаемых уровнях экспрессии.Тем не менее, важно тщательно количественно оценить пассивные свойства мембраны и оценить ширину AP при разработке новых индикаторов (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Gong et al., 2015).

Чувствительность

Чувствительность оптических индикаторов - важнейший параметр функциональной визуализации. Как указано выше, при разработке GEVI также сложнее всего улучшить.

Необходимость большой чувствительности к напряжению

Размер оптического сигнала является важным фактором, определяющим рабочие характеристики пробника по следующим причинам.

Во-первых, чувствительность датчика напрямую влияет на отношение сигнал / шум оптических сигналов. Высокий SNR необходим для надежной интерпретации данных, включая идентификацию подпороговых событий и высокоточное обнаружение всплесков. Во-вторых, высокая чувствительность на предварительных скринингах с культивированными клетками гарантирует, что оптический сигнал будет различим в толстых срезах мозга и экспериментах in vivo , где флуоресцентные ответы ослабляются тканевым поглощением, рассеянием, автофлуоресценцией и расфокусированной флуоресценцией. (см. раздел «Отношение сигнал / шум»).В-третьих, большие оптические сигналы позволяют обойтись без усреднения откликов по множеству разверток. Следовательно, они позволяют получать изображения в физиологических условиях, когда реакции могут варьироваться от испытания к испытанию. Зонд, который дает заметный сигнал в единичных испытаниях, позволяет обнаруживать нестационарные события, такие как спонтанные AP и всплески AP.

Повышение чувствительности к напряжению GEVI

ArcLight был одним из первых описанных GEVI, продемонстрировавших высокую чувствительность - его выход флуоресценции снижается на целых 40% Δ F / F 0 во время этапов деполяризации 100 мВ в клетках HEK, 5% в ответ на AP в культивируемых нейронах и острых срезах головного мозга и 2% in vivo в обонятельной луковице мыши (Jin et al., 2012; Cao et al., 2013; Kunst et al., 2014; Klein et al., 2015; Storace et al., 2015). Индикаторы на основе ASAP и Arch также были разработаны для демонстрации больших амплитуд отклика (Yang et al., 2016; Chamberland et al., 2017; Piatkevich et al., 2018).

Ориентация на FP или VSD Родительский зонд

ArcLight был сконструирован путем слияния pH-чувствительного варианта GFP, эклиптического pHluorin, с С-концом Ci VSD. Он показал предельную чувствительность -1.3% Δ F / F 0 на 100 мВ деполяризации в клетках HEK. Впоследствии случайное открытие - непреднамеренное замещение аланина аспарагиновой кислотой в положении 227 в β-стволе GFP (A227D) - привело к улучшенному варианту с Δ F / F 0 -18%. на 100 мВ (Jin et al., 2012) (Рисунок 3A).

Рис. 3. Мутации в последовательности FP, а также изменения длины линкера Ci VSD-FP влияют на чувствительность ArcLight по напряжению. (A) Флуоресцентные ответы на деполяризацию 100 мВ клеток HEK, трансфицированных Ci, VSD-эклиптическим pHфторином или Ci VSD-эклиптическим pHluorin A227D. (B) 100 мВ ступенчатые ответы (среднее ± SEM) клеток HEK, экспрессирующих варианты 227A или 227D каждого из Ci, VSD-эклиптического pHluorin, Ci VSD-eGFP или Ci VSD-SEP. (C) Кристаллическая структура eGFP (PDB ID 1EMG), выделяющая A227, а также шесть наиболее разнородных остатков между SEP и eGFP.Указаны версии SEP. Обратите внимание, что все четыре критических остатка 147, 227, 202 и 204 находятся на одной цилиндрической поверхности флуорофора. (D) Отклики флуоресценции (среднее ± SEM) Ci VSD-SEP вариантов, несущих мутации в указанных остатках в (C) . Эти мутации служат для замены аминокислот SEP соответствующими остатками, обнаруженными в eGFP. (E) Кривые pH-чувствительности мутантов SEP и SEP, содержащих остатки eGFP в указанных сайтах. (F) Средние амплитуды отклика на деполяризацию 100 мВ производных ArcLight с измененной длиной линкера. Группы, которые существенно отличаются от ArcLight S249, отмечены звездочками. Δ относится к сенсорам, показывающим плохую мембранную локализацию (Jin et al., 2012; Han et al., 2014).

Замена эклиптического pHluorin в ArcLight на суперэклиптический pHluorin (SEP), который содержит мутации F64L и S65T из улучшенного GFP (eGFP), снижает приобретенную чувствительность, но Δ F / F 0 можно восстановить простым повторным введением 227D (Рисунок 3B).Важно отметить, что замена аспарагиновой кислоты любой из других 18 аминокислот полностью или частично ослабляет оптический сигнал. Другая отрицательно заряженная аминокислота глутаминовая кислота, которая имеет дополнительный углерод, сохраняет только треть улучшенной чувствительности (-6% Δ F / F 0 на 100 мВ), что позволяет предположить, что как отрицательный заряд , так и уменьшенные стерические эффекты от компактной боковой цепи аспарагиновой кислоты имеют решающее значение для ответа напряжения (Jin et al., 2012).

В дополнение к A227D, другие остатки, специфичные для SEP и / или эклиптического pHluorin, по-видимому, играют роль в чувствительности ArcLight к напряжению. Это связано с тем, что ArcLight на основе eGFP / A227D, который отличается от SEP девятью мутациями, не может генерировать сигнал напряжения.

Исследования потери функции показывают, что на самом деле три мутации в β-стволе, уникальном для pHluorins - S147D, S202F и Q204T - необходимы для зависящей от напряжения флуоресцентной реакции ArcLight. Внесения этих мутаций вместе с A227D достаточно, чтобы сделать ArcLight на основе eGFP столь же чувствительным, как сенсор на основе SEP / 227D (Han et al., 2014) (Рисунки 3C, D).

Однако на сегодняшний день остается неясным, как эти аминокислоты преобразовывают напряжение в флуоресцентный сигнал. Были предложены некоторые правдоподобные механизмы, основанные на взаимодействии FP с мембраной, чувствительности к pH и олигомеризации.

Двухфотонная поляризационная микроскопия клеток HEK, трансфицированных ArcLight, предполагает, что SEP / 227D демонстрирует линейный дихроизм, что означает, что флуорофор, вероятно, ориентирован параллельно поверхности мембраны.Это наблюдение вместе с данными о кристаллической структуре GFP, которые показывают, что все четыре критических остатка имеют обращенные наружу боковые цепи и принадлежат соседним β-нитям (той же поверхности) ствола GFP, заставляют нас предположить, что зависимое от напряжения конформационное изменение в Ci VSD может перемещать FP ближе к мембране и модулировать силу взаимодействия между цилиндром и мембраной. Обратимые изменения силы этих взаимодействий могут, в свою очередь, влиять на хромофорное окружение и его депротонированное (флуоресцентное) состояние.

Кроме того, SEP демонстрирует изменения флуоресценции в зависимости от pH (рис. 3E). D147 служит внутренним датчиком pH, который сдвигает кривую чувствительности к основанию, доводя pKa GFP (pH при полумаксимальной флуоресценции) до почти нейтрального значения pH окружающей среды мембраны. Это также увеличивает крутизну кривой (> 1). Наклон больше единицы предполагает, что даже незначительные изменения pH, которые могут произойти во время AP, когда протоны мобилизуются электрическим полем, могут вызвать большое изменение флуоресценции.Остается неясным, действительно ли чувствительность к напряжению ArcLight возникает из-за измерения pH с помощью SEP. Замена других FP с подобными кривыми pH, таких как ратиометрический pHluorin или YFP, не позволяет генерировать варианты, чувствительные к напряжению, даже в присутствии A227D. Возможно, что мутации, уникальные для SEP, имеют решающее значение для чувствительности ArcLight, и отсутствие этих мутаций может привести к быстрой буферизации небольших изменений pH. Тем не менее, чувствительность SEP к pH, по-видимому, не только модулирует ответы ArcLight, поскольку мутации в Ci VSD могут независимо настраивать его чувствительность на различные диапазоны напряжения (см. Раздел «Зависимость оптических откликов от напряжения»).

Наконец, олигомеризация FP может также влиять на чувствительность к напряжению. Установка тандемного SEP после Ci VSD резко уменьшает размер ответа и меняет полярность оптического сигнала (+ 2% Δ F / F 0 на 100 мВ). Напротив, в индикаторе Pado на основе протонных каналов SEP / 227D мутация предполагаемого сайта димеризации FP снижает его чувствительность, указывая тем самым, что димеризация обычно стабилизирует оптический сигнал (Kang and Baker, 2016).Неясно, однако, существует ли SEP / 227D в виде димеров в интактных GEVI, и если да, то почему димеризация имеет разные эффекты в разных каркасах.

Для более точного выяснения механизма требуется электронная микроскопия и рентгеновские исследования кристаллизации для определения структуры интактного GEVI до и во время деполяризации. Однако мембранные белки довольно сложно кристаллизовать в их естественном свернутом состоянии (Parker and Newstead, 2016).

Аналогичным образом, было показано, что множественные мутации в ядре опсина, составляющем окрестности хромофора, приводят к значительному повышению чувствительности к напряжению в индикаторах на основе Arch (Hochbaum et al., 2014; Пяткевич и др., 2018).

Было также показано, что первичная последовательность преобразователя частоты регулирует чувствительность по напряжению. Недавно одиночная мутация R415Q в спирали S4 Gg VSD в ASAP открыла новый вариант ASAP2s с поразительно большой чувствительностью (-38% Δ F / F 0 на 100 мВ) к шагам деполяризации напряжения. Ответ представляет собой улучшение на 66% по сравнению с родительским шаблоном ASAP1 (-23% Δ F / F 0 на 100 мВ) (Chamberland et al., 2017). Однако мутация повлияла на кинетику ответа, снизив время нарастания с 2,9 до 5,2 мс. Это наблюдение не совсем удивительно, учитывая, что движения спирали S4 предположительно участвуют в измерении напряжения (см. Раздел «Источник VSD»).

В совокупности эти результаты указывают на важную роль первичной аминокислотной последовательности в регулировании характеристик напряжения индикатора.

Таргетинг на линкер

Помимо VSD и FP, изменение длины и состава последовательности AA в линкере между двумя доменами часто приводило к резкому улучшению чувствительности к напряжению.

Укорочение линкера между спиралью S4 Ci VSD и SEP / 227D удвоило амплитуду ответа ArcLight (∼35–40% против 18% Δ F / F 0 на 100 мВ). Это было достигнуто путем усечения линкера, по одной аминокислоте за раз от остатка S249 VSD, и приближения SEP к S4 до тех пор, пока оптический отклик не достигнет насыщения, а именно. между позициями S243 и Q239 (Рисунок 3F).

Точно так же замена и делеция, включающая две аминокислоты (A147S ΔA148) в линкере между спиралью S3 и FP в ASAP1, увеличили его оптический сигнал до ∼45% с 30% Δ F / F 0 на 50 мВ, хотя для ответов на гиперполяризацию (Yang et al., 2016).

Датчики флуоресцентного резонансного переноса энергии еще больше полагаются на оптимальную длину линкера (и состав AA), поскольку эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донорными и акцепторными FP. Например, GEVI QuasAr-mOrange2 типа 2 был получен путем постепенного укорачивания линкера путем усечения не только C-конца датчика напряжения и гасителя FRET QuasAr, но также N-конца донора FRET mOrange2 с последующей рандомизацией. двух остатков на пересечении (Zou et al., 2014).

Хотя уменьшение длины линкера в большинстве случаев повышает производительность, позволяя конформационным изменениям в VSD лучше проникать в FP, слишком близкое расположение двух мотивов может также мешать их колебательной свободе и ослаблять чувствительность. Например, приближение FP ближе, чем Q239 Ci VSD, снижает чувствительность ArcLight к напряжению. Более того, большие делеции в VSD и / или FP могут отрицательно влиять на фолдинг и экспрессию белка (Han et al., 2014; Zou et al., 2014). Мы заметили, что нетрадиционные FP со структурой, отличной от классической бочки, обычно требуют более длинных линкеров. Это может быть достигнуто путем введения одного или нескольких рандомизированных (NNK) кодонов на стыке и выбора инсерционных мутантов для повышения чувствительности к напряжению.

Полярность оптического сигнала

Большинство современных GEVI, за исключением автономных опсинов Arch семейства и FlicR1, обнаруживают снижение флуоресценции после деполяризации.Эти зонды с отрицательным наклоном зависимости между напряжением и флуоресценцией (кривые Δ V / Δ F ) ярче в условиях покоя, чем во время AP. Их высокая базовая флуоресценция может быть невыгодной, поскольку флуорофоры склонны к фотообесцвечиванию даже при интенсивности окружающего освещения, а потеря флуоресценции (уменьшение количества фотонов) может отрицательно сказаться на SNR. Кроме того, расфокусированная флуоресценция соседних покоящихся нейронов может увеличить уровень шума, еще больше ослабляя SNR в широкопольных записях интактной ткани.Например, в исследовании обоняния in vivo у мух посторонняя флуоресценция ArcLight из некопланарных клубочков загрязняла сигналы из представляющих интерес областей (ROI), содержащих соответствующие клубочки на поверхности антеннальной доли. Низкий SNR привел к пахучим ответам, несовместимым с опубликованными внеклеточными записями в периферических сенсиллах. Проблема была частично решена путем ограничения экспрессии ArcLight в определенных клубочках с помощью генетического нацеливания (Cao et al., 2013).

Низкая базовая флуоресценция, напротив, хорошо коррелирует с высокими SNR, как в случае с наиболее продвинутыми вариантами GCaMP (Chen et al., 2013). GCaMPs реагируют на AP, увеличивая их выход флуоресценции по сравнению с уровнями покоя.

Недавняя работа нашей лаборатории демонстрирует, что определенные мутации FP могут изменять полярность оптического сигнала. Замена трех остатков в SEP ArcLight на гидрофобные аминокислоты (D389A, h490A и Y442V) дает новый зонд с положительно наклонной кривой Δ V / Δ F .В то время как 389A служит для изменения полярности, другие, также на той же поверхности β-ствола, увеличивают амплитуду отклика в том же направлении. Однако гидрофильные или полярные остатки на этих участках меняют полярность на полярность ArcLight. Это открытие подтверждает аргумент о том, что чувствительные к напряжению движения в Ci VSD модулируют силу взаимодействий между FP и гидрофобной мембраной, и предполагает, что как чувствительность к напряжению, так и полярность оптических ответов могут быть изменены путем воздействия на флуорофор (Platisa et al., 2017).

Красный индикатор напряжения FlicR1 также показывает положительный ответ на деполяризацию (Abdelfattah et al., 2016). FlicR1 состоит из Ci VSD, слитого с cp-mApple. Неясно, происходит ли разворот из-за последовательности и геометрии mApple, которые отличаются от семейства GFP, или его круговой перестановки. Предыдущее исследование показало, что круговая перестановка может иметь двунаправленное влияние на полярность с некоторыми каркасами на основе Ci VSD / cp-eGFP, демонстрирующими положительную, а другие отрицательную реакцию на деполяризацию (Barnett et al., 2012).

Значение размера сигнала для экспериментов in vivo

Благодаря большому динамическому диапазону чувствительности индикаторы кальция идеально подходят для рутинной визуализации in vivo . Напротив, было продемонстрировано, что только несколько GEVI со значительной чувствительностью работают с in vivo и с (Cao et al., 2013; Carandini et al., 2015; Gong et al., 2015; Storace et al., 2015; Yang et al., др., 2016). Низкая чувствительность особенно проблематична для широкоугольной (однофотонной) микроскопии, где расфокусированная флуоресценция снижает SNR (Flusberg et al., 2008; Мукамель и др., 2009).

ArcLight был впервые визуализирован in vivo в Drosophila . Здесь зонд был генетически нацелен на определенные обонятельные сенсорные нейроны (OSN), управляя экспрессией ArcLight с промоторов клеточно-специфических генов обонятельных рецепторов. Настройка одоранта пресинаптических OSN и их гломерулярных проекций изучалась с помощью широкопольной визуализации с помощью синего лазера (488 нм). Оптические сигналы собирались на частоте 125 Гц с помощью камеры с малошумящим устройством с зарядовой связью (ПЗС).Как и ожидалось на основании установленных электрических записей сенсилл, различные подтипы OSN, экспрессирующие ArcLight, демонстрировали возбуждающие реакции (до -5% Δ F / F 0 ) на выбор одорантов с высокой степенью настройки одоранта. Сигналы были различимы в записях единичных испытаний и сообщали об относительных различиях в силе реакции на разные одоранты и разные дозы. Например, клубочки DC2 проявляли более сильную реакцию на 3-октанол, чем на 1-бутанол (-5% против -2% Δ F / F 0 ).Кроме того, ArcLight также выявил ингибирующие ответы в VA1v с аналогичной чувствительностью (Cao et al., 2013) (Рисунок 4).

Рис. 4. ArcLight сообщает о пахучих ответах в единичных пробных записях на Drosophila . (A) Схематическое изображение in vivo эксперимента по визуализации антенны Drosophila после презентации одоранта. (B) Схематическая диаграмма двусторонних лепестков антенн, отображающая проекции OSN, экспрессирующих Or56a, Or13a или Or47b, на их соответствующие клубочки. (C) Репрезентативные оптические записи мембранной активности на пресинаптических окончаниях OSN после нанесения указанного запаха. Желтое поле указывает время нанесения запаха. Цвета указывают на различные концентрации запаха 10, 1 или 0,1% или записи, полученные из левого (L) или правого (R) клубочков. Масштабные полосы = 10 мкм (панели 2 и 4) и 20 мкм (панели 1 и 3) (Cao et al., 2013).

ASAP2f, который был разработан для демонстрации высокой чувствительности и улучшенной кинетики, использовался для определения характеристик визуального отклика на лету с превосходной чувствительностью до -10% Δ F / F 0 в усредненных развертках.Данные, полученные с помощью двухфотонного микроскопа, обеспечивали высокое пространственное разрешение для визуализации субклеток (Yang et al., 2016).

Аналогичным образом, Ace2N-mNeon, высокоскоростной индикатор FRET-опсина, состоящий из опсина Acetabularia и mNeonGreen, может сообщать о свойствах настройки ориентации в редко маркированных зрительных корковых нейронах мыши с амплитудами ответа -3% Δ F / F 0 за AP. Зонд, который показывает ~ -10% Δ F / F 0 на AP в культивируемых нейронах, имеет превосходную кинетику, которая компенсирует очевидную низкую чувствительность и увеличивает скорость обнаружения спайков in vivo (Gong et al., 2015).

Хотя формирование изображений с широким полем может ослабить SNR, смешивая оптические сигналы с расфокусированной флуоресценцией, нацеливание зондов на определенные типы клеток может минимизировать неспецифическую маркировку и улучшить качество изображения. Такие записи с низким уровнем шума позволяют выделить отдельные ответы в единичных испытаниях. Кроме того, они полезны для измерения активности определенных типов клеток, недоступных для электродов, таких как нейроны циркадных часов Drosophila (Cao et al., 2013).

Оптическим записям у мышей также способствует целенаправленная экспрессия индикаторов в генетически идентифицированных популяциях, за которыми следуют истонченные препараты черепа или имплантаты черепного окна, позволяющие визуализировать интактную ткань. Однако визуализация в реальном времени у мышей связана с такими проблемами, как артефакты движения от дыхания и пульсации кровеносных сосудов, гемодинамические артефакты от поглощения света (λ <650 нм) гемоглобином и зеленая автофлуоресценция от эндогенных хромофоров, никотинамидадениндинуклеотида и флавопротеинов.Все вышеперечисленное может существенно испортить сигналы и может быть особенно проблематичным при использовании индикаторов с синим смещением. Некоторые из этих проблем могут быть решены путем разработки зондов с красным смещением, применения стратегий временной и пространственной фильтрации или логометрической визуализации с индикаторами FRET. Однако в долгосрочной перспективе повышение чувствительности и SNR является ключом к улучшению обнаружения событий in vivo. Действительно, после описания GCaMP3 в этой области наблюдался огромный всплеск использования GECI, который затем показал достаточно большой динамический диапазон чувствительности от ∼10 до ∼120% Δ F / F 0 для AP и Вероятности обнаружения пиков, которые коррелируют с размером ответа (Tian et al., 2012).

Соотношение сигнал / шум

SNR сигналов напряжения обеспечивает меру точности индикатора для определения частоты (и времени) отдельных всплесков и подпороговых сигналов. Большой SNR позволяет обнаруживать события из одиночных испытаний, устраняя необходимость в усреднении. SNR оптических записей зависит от внутренних свойств индикатора, таких как яркость, квантовый выход и длины волн возбуждения / испускания, а также от внешних факторов, таких как экспрессия белка, мембранный перенос, интенсивность освещения, источники шума, эмиссионный фильтр, числовая апертура ( NA) цели и выбор детектора.

Выбор флуоресцентного белка

Важным первым шагом в разработке зонда является выбор FP с высоким квантовым выходом флуоресценции (φ), яркостью, которая является произведением φ на коэффициент экстинкции (), и фотостабильностью. FP, такие как eGFP, mNeonGreen, mCitrine и mRuby, имеют высокие значения φ (0,5–0,8) и яркость (60–90) и являются отличными зондами с высоким отношением сигнал / шум (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Gong et al., 2015; Bajar et al., 2016). Напротив, производные Arch, которые работают как автономные GEVI, имеют флуоресценцию φ порядка от 10 -4 до 10 -3 .Хотя опсины все еще могут давать сигналы с высоким отношением сигнал / шум при высокой интенсивности освещения (от 880 мВт мм -2 до 8 Вт мм -2 , в 18–80 раз больше, чем требуется для зондов на основе GFP) и в сочетании с чувствительным электронным умножением -CCD или дополнительные металлооксидные полупроводниковые (cMOS) детекторы (Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014), они непрактичны для изучения неповрежденной ткани, поскольку высокая интенсивность света может вызвать нагрев образца, фотоповреждение и автофлуоресценцию ткани. С тех пор они были адаптированы в зонды опсин-FRET, где они слиты со стандартными флуорофорами, чтобы обеспечить улучшенное обнаружение в стандартных условиях.

Фотостабильность, определяемая как время фотообесцвечивания до полуфлуоресценции при постоянном освещении, является еще одним фактором, ухудшающим SNR, особенно во время длительных сеансов записи. Фотостабильные зонды демонстрируют отбеливание от слабого до умеренного во время эксперимента и не требуют обширной коррекции отбеливания для выделения сигналов. Индикаторы на основе GFP имеют тенденцию к фотообесцвечиванию быстрее, чем опсины, ограничение, приписываемое свойствам доступных в настоящее время флуорофоров.

Спектральные свойства FP также влияют на SNR для in vivo визуализации .Оптические сигналы, особенно от зондов с синим смещением (λ <650 нм), склонны к ослаблению из-за поглощения и рассеяния в головном мозге и имеют низкий контраст на фоне автофлуоресценции зеленой ткани. Зонды с красным смещением меньше подвержены потерям из-за поглощения или рассеяния, а коэффициент затухания при 600–700 нм составляет примерно половину от коэффициента затухания при 500 нм. В результате их оптическое пропускание (проникновение в ткани) почти вдвое выше (Flock et al., 1992; Al-Juboori et al., 2013).

Однако следует иметь в виду, что оптические и спектральные свойства FP могут не применяться к сконструированному GEVI, потому что слияние FP с VSD и мутация его первичной последовательности может влиять на укладку белка и окружение хромофора, существенно изменяя нативный флуорофор.

Пробное выражение

Исключительная экспрессия GEVI в плазматической мембране важна для минимизации загрязнения полезных сигналов внутриклеточной флуоресценцией, устойчивой к изменениям напряжения. В некоторой степени это может быть достигнуто путем вставки сигналов мембранного переноса в кодирующую последовательность или объединения pH-чувствительных флуорофоров, таких как эклиптический pHluorin и SEP, флуоресценция которых «затмевается» в кислых внутриклеточных компартментах. Кроме того, адекватная экспрессия трансгена требует использования подходящих векторов для доставки генов, таких как рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) или плазмидная ДНК для электропорации in utero .

Также важно добиться разреженной экспрессии индикаторов в избранных нейронах, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию из-за ослабления отношения сигнал / шум. Для некоторых типов нейронов, таких как кортикальные пирамидные клетки и интернейроны, послойно-специфическая экспрессия может быть достигнута путем доставки плазмидной ДНК к эмбрионам беременных мышей через in utero электропорации (Wang and Mei, 2013; De Marco Garcia and Fishell, 2014). Определенные нейрональные подтипы также могут быть нацелены на использование различий в профилях экспрессии их генов.Используя промоторы, специфичные для клеточного типа, вместе с комбинаторными стратегиями нацеливания на гены, такими как Cre-рекомбиназа / loxP или системы трансактивации тетрациклина (tTA), можно как пространственно, так и временно регулировать экспрессию индикатора.

Оптические приборы

Как и в любой флуоресцентной микроскопии, соотношение сигнал / шум при функциональной визуализации также зависит от оптической схемы.

Объективы с высокой числовой апертурой (NA) (∼1,2) могут доставлять больше возбуждающих фотонов и собирать больше флуоресцентных фотонов, тем самым повышая яркость сигнала и разрешение [разрешаемое расстояние R = λ / (2 × NA )] (Piston, 1998 ).В сочетании с детекторами с высоким разрешением они позволяют лучше определять области интереса. Интенсивность освещения должна быть достаточной для преодоления ограничений дробового шума из-за стохастических флуктуаций количества фотонов. Тем не менее, интенсивность света не должна быть чрезмерной, так как это может ускорить фотообесцвечивание, вызвать нагревание образца и фототоксичность. Точно так же следует тщательно выбирать фильтры излучения, чтобы свести к минимуму загрязнение флуоресценции возбуждающим светом, который может сильно затенять сигналы.ФП с большим стоксовым сдвигом - разницей между максимумами поглощения и излучения - полезны для предотвращения спектрального перекрытия (Пяткевич и др., 2010, 2013; Чу и др., 2016).

Выбор детектора - еще один фактор, который может повлиять на отношение сигнал / шум. Камеры CCD, такие как предлагаемые RedShirt Imaging, LLC, особенно подходят для высокоскоростной визуализации с частотой до 2 кГц или 5 кГц с объединением 3 × 3 пикселя и позволяют обнаруживать оптические отклики на точки доступа. Учитывая их высокую квантовую эффективность (> 80%) - показатель процента обнаруженных фотонов - и низкий уровень шума считывания, эти камеры обеспечивают отношение сигнал / шум, близкое к теоретическому максимуму.

Хотя обычная однофотонная микроскопия обеспечивает высокую скорость сбора данных, поскольку фотоны отбираются параллельно, двухфотонное лазерное сканирование является лучшим вариантом для визуализации in vivo , поскольку оно обеспечивает превосходное соотношение сигнал / шум благодаря трехмерному оптическому сечению и улучшенному пространственному разрешению. Индикаторы на основе VSD типа 1, такие как ArcLight и ASAP2f, успешно использовались для визуализации медленной динамики внутриклеточного напряжения in vivo (Cao et al., 2013; Storace et al., 2015; Ян и др., 2016). Например, ArcLight сообщает о пахучих ответах в популяциях обонятельных клубочков с чувствительностью примерно от -1 до -2% Δ F / F 0 в однократных пробных записях под двухфотонной микроскопией, как и при широкоугольной визуализации (Storace et al. др., 2015). Однако большое время пребывания пикселей современных лазеров и низкая частота кадров (10–100 Гц) не позволяют использовать их при отображении реакции на быстрые колебания напряжения, а именно. AP (длительность <1-2 мс). Чтобы решить эту проблему, недавно было продемонстрировано, что сканирование с произвольным доступом, которое обеспечивает высокую скорость сбора данных до 1 кГц, хорошо работает с новым вариантом ASAP ASAP2.Тем не менее, несмотря на то, что большая чувствительность ASAP2s (-15% Δ F / F на AP в условиях широкопольного изображения) была подтверждена при двухфотонной микроскопии, зонд сильнее пострадал от фотообесцвечивания во время лазерного сканирования по сравнению с однофотонным. изображения (Chamberland et al., 2017).

Неясно, оптимизированы ли GEVI на основе опсина для двухфотонной визуализации. Недавние исследования показали, что опсиновые GEVI, такие как индикаторы на основе Arch, Ace-mNeon и MacQ-mCitrine, плохо работают под лазерной сканирующей микроскопией.Преобладающая гипотеза состоит в том, что фемтосекундный импульсный лазер, вероятно, мешает фотоциклу родопсина, а GEVI опсина могут не удерживаться в своем чувствительном к напряжению состоянии во время «темной» фазы (Brinks et al., 2015; Chamberland et al., 2017).

В качестве альтернативного метода визуализации недавно было показано, что мощный волоконно-оптический метод позволяет регистрировать трансмембранную динамику напряжения, специфичную для клеточного типа, с использованием индикаторов опсин-FRET. Техника записи 0-D, получившая название T ransmembrane e lectrical m измерения p , выполненная o вертикально или TEMPO, позволяет активировать флуоресценцию лазерными лучами, доставляемыми через оптические волокна, и обнаруживать сигнал с помощью фотоприемников, соединенных с замком. -в усилителях.Этот метод предлагает чувствительность, приближающуюся к теоретическим пределам, налагаемым дробовым фотонным шумом (Marshall et al., 2016).

В принципе, можно использовать высокоскоростную эпифлуоресцентную визуализацию для регистрации спайков in vivo , но данные потребуют тяжелой постобработки, чтобы отличить ответ напряжения от фоновой флуоресценции. Кроме того, изображения по-прежнему предоставляют мало пространственной информации, о которой можно судить только по обработанным сигналам. В исследовании, описывающем Ace2N-mNeon, оптические отклики на спонтанное срабатывание in vivo были зафиксированы с использованием широкоугольной визуализации с частотой сбора данных до 2 кГц.Нейроны были локализованы за счет электрической активности ококлеточного электрода. Изображения были подвергнуты вычитанию фона, и отклики напряжения были выборочно извлечены из пикселей, которые демонстрировали верхние 20% -ные значения SNR, которые в основном соответствовали интересующим сомам (Gong et al., 2015).

Кинетика отклика

Повышение скорости индикаторов напряжения для отслеживания отдельных точек доступа и устранения быстрых скачков напряжения может повысить их полезность в исследованиях в области нейробиологии.Однако, как упоминалось выше, усовершенствования методов визуализации должны дополнять разработку GEVI, направленную на улучшение кинетики ответа.

В ArcLight и других GEVI на основе VSD кинетика в значительной степени контролируется движениями VSD, считывающими напряжение. В ответ на колебания напряжения VSD демонстрируют движение «стробирующего» заряда, которое, как часть нативных ионных каналов и чувствительных к напряжению фосфатаз, облегчает стробирование каналов или активацию ферментов. Структурные исследования показывают, что активация напряжением Ci VSD заставляет спираль S4 скользить вверх на ∼5 Å вдоль своей главной оси и вращаться на ∼60 °, чтобы мобилизовать предполагаемые стробирующие заряды - серию равномерно расположенных аргининов ( Mannuzzu et al., 1996; Ян и др., 1996; Li et al., 2014) (Рисунки 5A, B). Предполагается, что это конформационное изменение распространяется на FP в индикаторах напряжения, тем самым модулируя их выход флуоресценции.

Рисунок 5. Кинетика генетически закодированных индикаторов напряжения и зависимость оптических откликов от напряжения во многом зависят от чувствительных к напряжению конформационных изменений в его VSD. (A) Кристаллическая структура VSD Ciona Кишечник напряженно-чувствительной фосфатазы (PDB ID 4G7V).Показаны четыре трансмембранные спирали S1 – S4. S4 выделен красным. Положение стробирующих аргининов R1 – R4 (каждая третья аминокислота, начиная с 223), а также крайнего аргинина R0 S4 (положение 217 в Ci VSD) показаны синим цветом. Противозаряды D1 (на спирали S2), D2 и E3 (на спирали S3) показаны красным. (B) Механистическая модель измерения напряжения в Ci VSD. Активированное состояние UP сопровождается движением вниз S4 на 5 Å и поворотом всей спирали на ~ 60 ° против часовой стрелки.Затем аргинины стабилизируются последовательными отрицательными обратными зарядами, от пар R1 – D1, R2 – D2 и R3 – D3 в состоянии покоя или ВНИЗ, до R2 – D1, R3 – D2 и R4 – E3 в конфигурации UP. (C) Выравнивание последовательностей трансмембранных сегментов VSD ортологов чувствительных к напряжению фосфатаз. Положительные, отрицательные и полярные остатки обозначены красным, синим и фиолетовым цветом соответственно. Нумерация соответствует нумерации гомолога Ciona (Li et al., 2014; Piao et al., 2015).

Напротив, чувствительность к напряжению индикаторов на основе опсина зависит не от движений сенсора, а от изменений протонированного состояния хромофора сетчатки.Считается, что эти изменения происходят практически мгновенно во время переходных процессов напряжения, и в результате большинство автономных опсинов и опсин-FRET GEVI демонстрируют ускоренную кинетику в субмиллисекундных временных масштабах.

Источник VSD

Быстрая кинетика впервые была обнаружена в индикаторе напряжения на основе ионных каналов SPARC. SPARC состоит из натриевого канала скелета крысы rNav1.4, слитого с eGFP, который вставлен во внутриклеточную петлю между его вторым и третьим доменами. Быстрая кинетика флуоресцентного отклика (экспоненциальное время нарастания τ-on <1 мс; <0.5% Δ F / F 0 на 100 мВ) отражает быстрые зависящие от напряжения движения стробирующего заряда, вероятно, в трансмембранных доменах I и II (Ataka and Pieribone, 2002).

Большинство датчиков на основе Ci VSD имеют медленное время нарастания, продолжающееся десятки миллисекунд, и более медленное затухание, составляющее около 80–100 мс (Димитров и др., 2007; Цуцуи и др., 2008; Перрон и др., 2009; Джин и др. др., 2012). ArcLight-Q239, вариант с самым коротким линкером и максимальной чувствительностью, демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику со временем включения 9 (τ1) и 48 (τ2) мс, и временем отключения 17 (τ1) и 60 (τ2) мс ( на 100 мВ).Быстрые компоненты (τ1s) при нарастании и затухании составляют 50 и 80% от полной амплитуды соответственно.

Было показано несколько подходов к изменению кинетики датчиков на основе VSD. Одним из них была простая замена Ci VSD ортологами. Замена Dr VSD или Gg VSD, например, генерирует варианты ArcLight с более быстрой и простой кинетикой (одиночная экспонента) с постоянными времени τ-on и τ-off ∼5 и ∼9 мс соответственно. Эти варианты, однако, демонстрируют пониженную чувствительность по сравнению с вариантом Ci VSD, предположительно из-за измененных взаимодействий между ортологами VSD и SEP 227D.Тем не менее, куриный ArcLight может обнаруживать AP в культивируемых нейронах в единичных испытаниях с чувствительностью ∼-3% Δ F / F 0 и разрешать моделируемые AP при 100 Гц в клетках HEK (Han et al., 2013 ).

VSD рыбок данио и кур аналогичным образом усиливают кинетику ответа как часть других каркасов GEVI. Например, Zahra, сочетание Dr VSD и пары CFP / YFP FRET, демонстрирует постоянные времени ∼3,5–5 мс на 100 мВ деполяризации, что является значительным улучшением по сравнению с его предшественником VSFP2 на основе Ci VSD.1 (Димитров и др., 2007; Baker et al., 2012). Аналогичным образом, другой датчик Mermaid на основе FRET демонстрирует улучшенную кинетику по сравнению с Gg VSD-ArcLight, когда Ci VSD заменяется ортологом курицы (Tsutsui et al., 2008; Han et al., 2013). Gg VSD также придает превосходную кинетику ASAP1 / 2, в которой GFP cp-superfolder вставлен во внеклеточную петлю S3 – S4. Хотя ASAP1 / 2 демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику, в ответах преобладают быстрые компоненты (τ1 = 2 мс) (St-Pierre et al., 2014).

Напротив, ДМЖП лягушки и человека ухудшают кинетику ArcLight, генерируя ответы медленнее, чем версия Ciona (τ-on = 11 и 70 мс, τ-off = 155 и 70 мс, соответственно) (Рисунки 6A, B). Интересно, почему разные ортологи ДМЖП демонстрируют дифференциальную кинетику. Отчасти расхождения, по-видимому, связаны с вариациями в их первичной последовательности, которая может влиять на скорость движения стробирующего заряда.

Рис. 6. Изменение вида VSD или круговая перестановка FP усиливает кинетику GEVI (A) τ-on и τ-off оптических ответов на деполяризацию 100 мВ в клетках HEK, трансфицированных производными ArcLight на основе лягушки, курицы, данио или человеческий вольт-чувствительный ортолог фосфатазы. (B) Вверху слева: конфокальное изображение культивированного нейрона гиппокампа, экспрессирующего куриный ArcLight. Масштабная линейка = 20 мкм. Внизу слева: изображение нейрона с помощью быстрой ПЗС-камеры размером 80 × 80, из которого были получены электрические и оптические записи на правой панели. Области интереса имеют цветовую кодировку, соответствующую цветам соответствующих оптических трасс. Справа: единичные пробные записи вызванных AP с использованием куриного ArcLight. Записи соматических и нейритов подвергались низкочастотной фильтрации с использованием гауссовского фильтра 95 и 50 Гц соответственно.Нефильтрованные следы показаны светлыми линиями. (C) Слева: широкоугольное изображение нейрона гиппокампа, экспрессирующего ElectricPk. Масштабная линейка = 15 мкм. Справа: одиночный (светло-красный след) и усредненный (красный след) оптические и электрические ответы на вызванные AP в нейроне слева. Оптические отклики регистрировали с помощью камеры NeuroCCD (RedShirt Imaging, LLC) на частоте 2 кГц. (D) Нормированные кривые Δ V / Δ F для производных ArcLight A242 – R217, S249 – R217 и S249 – Q217.242 и 249 представляют сайты слияния FP на линкере VSD Ci . 217 относится к самому внешнему аргинину на спирали S4 (Barnett et al., 2012; Han et al., 2013, 2014).

Выравнивание последовательностей ортологов VSD 29 видов показывает, что хотя несколько остатков по спиралям являются высококонсервативными, с поразительно похожими аргининовыми повторами в S4, заметные различия существуют в некоторых из этих сайтов. Комбинаторные мутации вариабельных остатков в Ci VSD (рис. 5C) привели к разработке быстрого сенсора Bongwoori, содержащего SEP / 227D. Ci VSD в Bongwoori содержит мутации в спиралях S2 и S4 (A154D / R229I), которые усиливают его кинетику, а также мутацию S4 R217Q, которая увеличивает чувствительность к отрицательным потенциалам. Зонд показывает такое же τ-on (~ 8 мс), что и ArcLight, но быстрый компонент составляет большую долю от общего экспоненциального затухания (91% против 50%). Его τ-off составляет 7 мс (Piao et al., 2015).

Круговая перестановка FP

Кинетика индикатора напряжения ограничивается не только движениями датчика напряжения, но также эффективностью и скоростью взаимодействия между датчиком и флуорофором во время этих движений.

Круговая перестановка FP, независимо от вида VSD, усиливает кинетику ответа. ElectricPK, быстрый датчик напряжения, был обнаружен во время проверки чувствительности к напряжению среди серии каркасов Ci VSD-cp-eGFP. Этот зонд, как и многие другие кандидаты с экрана, демонстрировал быструю скорость включения и выключения ~ 2 мс. ElectricPK может надежно разрешать короткие высокочастотные импульсы деполяризации в клетках HEK и AP в нейронах гиппокампа с дискретными оптическими ответами, не заслоняемыми накоплением дрейфа базовой линии (Barnett et al., 2012) (Рисунок 6C).

Сходным образом, слитый белок Ci VSD-cp-mApple FlicR1 демонстрирует быструю кинетику (τ1 = ∼3 мс), при этом в ответах преобладают быстрые компоненты. FlicR1 был разработан случайным мутагенезом и содержит восемь мутаций в своем VSD. Следовательно, неясно, является ли увеличение скорости результатом одной круговой перестановки или дополнительных изменений кинетики VSD (Abdelfattah et al., 2016). Это также относится к ASAP1 / 2, где как компоненты VSD, так и сборка FP подходят для ускоренного измерения напряжения.

После активации напряжения Ci VSD, по-видимому, претерпевает несколько структурных перестроек. Хотя первоначальный отклик быстрый и включает в себя движение стробирующего заряда, за ним следуют другие более медленные и, вероятно, независимые от напряжения переходы. Эти два компонента динамики VSD отражаются в FP и, следовательно, на выходе флуоресценции GEVI (Kohout et al., 2008; Villalba-Galea et al., 2009). Все согласны с тем, что FP более медленных датчиков напоминают оба типа движений VSD, тогда как FP более быстрых датчиков фиксируют только первый.В частности, FP с круговой перестановкой эффективно сочетаются с быстрыми движениями, поскольку они более уязвимы для деформации ствола и быстро дестабилизируются, учитывая их неоптимальную конфигурацию.

Кинетика идеального датчика напряжения

Учитывая, что AP являются быстрыми событиями, можно предсказать, что GEVI с субмиллисекундной кинетикой может умело разрешить быструю последовательность AP, предоставляя точную информацию как о частоте всплесков, так и о времени. Действительно, GEVI на основе опсина с субмиллисекундной кинетикой, возникающей из переходов состояний сетчатки в микросекундные временные шкалы, обеспечивают превосходное временное разрешение для обнаружения спайков (Maclaurin et al., 2013; Гонг и др., 2014, 2015; Zou et al., 2014). Однако было показано, что точность обнаружения пиков для зонда d ' зависит не от временной точности перекрытия между оптическим сигналом и формой сигнала AP, а, скорее, от длительности оптического сигнала, даже если она превышает таковую для нижележащего спайк (Wilt et al., 2013).

В условиях ограничения дробового шума фотонов современные детекторы предлагают d ′ , что зависит от размера сигнала Δ F / F , яркости датчика F 0 и времени затухания сигнала τ, такого что d ≈ (ΔF / F) • (F0τ) / 2 (Wilt et al., 2013). Помимо улучшения чувствительности и яркости зондов, увеличение времени затухания оптического сигнала улучшает d ', так как позволяет собирать дополнительные фотоны сигнала для каждого события сверх фона. Таким образом, оптический индикатор с быстрым подъемом, способный точно определять начало спайков, но затяжное затухание, может эффективно улучшить обнаружение спайков. Тем не менее, такие индикаторы могут не предоставлять точную информацию о времени всплеска, когда всплески достигаются с частотами, превышающими разрешаемый предел индикатора.

Таким образом, при выборе индикатора для кинетики реакции можно рассмотреть экспериментальные приоритеты, такие как то, требует ли данный биологический вопрос точного обнаружения всплесков, оценки времени всплесков или оценки подпороговых изменений напряжения. В то время как быстрые GEVI могут хорошо подходить для первого типа вопросов, более медленные GEVI могут быть ценными инструментами для изучения входных паттернов в локальных цепях, таких как изменения напряжения от синаптической передачи и медленные колебания напряжения в масштабах всей популяции.

Зависимость оптических откликов от напряжения

Общая цель инженерии GEVI - разработать оптические индикаторы, чувствительные как к деполяризации, так и к гиперполяризации, обеспечивающие абсолютные измерения изменения напряжения и работающие в диапазоне физиологического напряжения для нейронов (напряжение полумаксимального отклика флуоресценции В 1 / 2 ≈ -70 мВ). Все это может быть достигнуто путем оптимизации кривой Δ V / Δ F датчика.

Свойства кривой Δ V / Δ F также определяются мотивом измерения напряжения GEVI.Поскольку нативные VSD активируются деполяризацией мембраны, зависимость движения стробирующего заряда от напряжения смещается в сторону положительных потенциалов. Это означает, что GEVI, включающие преобразователи частоты дикого типа, будут работать только при сильно деполяризующих напряжениях. Однако можно расширить диапазон чувствительности преобразователя частоты, включив в него менее деполяризующие и даже гиперполяризующие напряжения. Например, в калиевом канале Shaker нейтрализация внешнего положительного заряда в S4 (R362Q) вызывает движение стробирующего заряда даже при напряжениях ниже -70 мВ (гиперполяризация) (Seoh et al., 1996). Аналогичные мутации в VSD, полученных из фосфатазы, аналогичным образом расширяют их чувствительность, повышая эффективность GEVI в широком диапазоне напряжений.

Мутация Ci VSD R217Q и соответствующие мутации Gg VSD и Dr VSD (R153Q) увеличивают чувствительность GEVI к гиперполяризующим потенциалам и приводят к сдвигу влево кривой Δ V / Δ F ( Рисунок 6D). Соответственно, эти мутации получили широкое распространение в ряде зондов (Димитров и др., 2007; Цуцуи и др., 2008; Baker et al., 2012; Хан и др., 2013, 2014; Piao et al., 2015). Нейтрализация встречного заряда (D164) в спирали S2 также увеличивает чувствительность к отрицательным напряжениям (Piao et al., 2015). Увеличивая чувствительность к гиперполяризации, эти мутации служат для размещения V 1/2 ближе к мембранному потенциалу покоя. На практике, однако, V 1/2 сильно варьируется в зависимости от GEVI и во многих датчиках все еще склоняется к деполяризации (от -35 до -3 мВ) (Tsutsui et al., 2008; Jin et al., 2012; Piao et al., 2015). Несоответствие предполагает, что дополнительные факторы, такие как связь между VSD и FP, могут играть роль в определении зависимости оптических характеристик от напряжения.

Помимо отрицательных сдвигов, наклон кривой Δ V / Δ F является еще одним показателем чувствительности датчика при различных напряжениях. Например, датчик с большим наклоном, который показывает большую Δ F для небольших колебаний напряжения, может быть полезен для мониторинга изменений подпорогового напряжения, тогда как GEVI с меньшим наклоном показывает такое же абсолютное Δ F , но при большие изменения напряжения могут быть подходящими для обнаружения всплесков напряжения.По крайней мере, одним фактором, который, по-видимому, влияет на наклон кривой Δ V / Δ F , является присутствие заряженных остатков в S2 (Piao et al., 2015). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять зависимость оптических характеристик от напряжения, чтобы иметь возможность лучше адаптировать GEVI для удовлетворения конкретных экспериментальных потребностей.

Заключение

За два десятилетия, прошедшие с момента их открытия, мы начали понимать проблемы, связанные с разработкой GEVI, и стремимся создавать лучшие зонды с повышенной экспрессией мембраны, чувствительностью к напряжению и SNR, а также адаптировать их скорость и динамический диапазон напряжения для удовлетворения экспериментальных потребностей. .Поскольку каждый GEVI имеет свои уникальные преимущества и служит различным целям в лаборатории, может быть трудно представить себе идеальный датчик, который сочетал бы в себе лучшие качества всех существующих датчиков и предоставлял бы единодушное решение для всех экспериментальных требований. Вместо этого цель разработки GEVI должна состоять в том, чтобы извлечь выгоду из потенциала данного зонда и максимизировать его полезность путем стратегического и тщательного проектирования.

Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения включает как минимум три этапа - разработку, поставку и диагностику.Разработка начинается с анализа кристаллических структур белков, если таковые имеются, и просмотра больших объемов литературы для разработки предварительного каркаса. Затем генетическая последовательность предполагаемого индикатора напряжения должна быть спроектирована путем направленной эволюции, а мутанты итеративно проверены на предмет их работоспособности. Хотя в прошлом усилия с низкой и средней производительностью были сосредоточены на ручном иерархическом скрининге яркости и чувствительности к напряжению, были предприняты значительные шаги для автоматизации этих процессов и повышения пропускной способности.Теперь можно демократизировать проектирование напряжения с помощью роботизированных систем и серийно оптимизировать миллионы вариантов для множества параметров, таких как яркость, расположение мембраны и чувствительность к напряжению (Пяткевич и др., 2018). Аналогичным образом, в нашей лаборатории мы разработали полуавтоматические микроскопические системы, которые оснащены полевыми электродами и чувствительными детекторами для одновременной оптимизации индикаторных конструкций в формате 96-луночного планшета для определения характеристик напряжения, яркости и локализации при высокой производительности и высоком содержании (Kannan и другие., 2018).

После того, как зонд адекватно оптимизирован для регистрации нейрональной активности и охарактеризован в культуре клеток, следующим шагом будет его доставка животным для мониторинга его пригодности в интактных цепях in vivo. Это может быть достигнуто путем инъекции рекомбинантных вирусов или электропорации плазмидной ДНК, кодирующей сконструированный GEVI. Выбор промотора, использование индуцибельных регуляторов экспрессии генов и время доставки генов могут нацеливать экспрессию индикатора на определенные типы клеток на определенных стадиях развития.

Последний шаг - диагностика. Хотя большая часть инноваций происходит на ранней стадии открытия, диагностика, возможно, является наиболее творческой фазой разработки GEVI. Он включает в себя разработку экспериментальной парадигмы, которая позволяет исследовать весь спектр приложений, в которых может быть полезен индикатор. Зонд можно использовать в качестве репортера спонтанной или вызванной стимулом активности, пластичности, связанной с развитием или зависящей от опыта, обучения и памяти или других форм поведения. Также может потребоваться адаптация хирургической и оптической схемы к датчику.Новые красные и дальние красные индикаторы могут нуждаться в адекватной демонстрации их способности мультиплексироваться с оптогенетическими инструментами с синим смещением и другими типами индикаторов с минимальным перекрестным оптическим взаимодействием.

Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения требует пересмотра основ механизмов, зависящих от напряжения, отличных от клеточной кальциевой передачи сигналов, а также понимания и оценки преимуществ пробников напряжения, которые вдохновляют нас в трудном процессе инноваций.Принимая во внимание постоянный прогресс в области разработки зондов и ожидаемые разработки в области технологий визуализации, мы, вероятно, сейчас ближе к нашей цели, чем когда-либо прежде.

Авторские взносы

Рукопись написали

MK, GV и VP. МК и Г.В. подготовили цифры.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Abdelfattah, A. S., Farhi, S. L., Zhao, Y., Brinks, D., Zou, P., Ruangkittisakul, A., et al. (2016). Яркий и быстрый красный флуоресцентный индикатор напряжения белка, который сообщает об активности нейронов в органотипических срезах мозга. J. Neurosci. 36, 2458–2472. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3484-15.2016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Park, Y.K, Iwamoto, Y., and Knopfel, T.(2012). Визуализация динамики нейронной цепи с помощью чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. J. Neurophysiol. 108, 2323–2337. DOI: 10.1152 / jn.00452.2012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Akerboom, J., Carreras Calderon, N., Tian, ​​L., Wabnig, S., Prigge, M., Tolo, J., et al. (2013). Генетически закодированные индикаторы кальция для многоцветной визуализации нейронной активности в сочетании с оптогенетикой. Фронт. Мол. Neurosci. 6: 2. DOI: 10.3389 / fnmol.2013.00002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., Tian, ​​L., Marvin, J. S., Mutlu, S., et al. (2012). Оптимизация индикатора кальция GCaMP для визуализации нервной активности. J. Neurosci. 32, 13819–13840. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2601-12.2012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аль-Джубури, С. И., Дондзилло, А., Стаблфилд, Э. А., Фелсен, Г., Лей, Т.К., и Клуг, А. (2013). Свойства светорассеяния различаются в разных областях мозга взрослой мыши. PLoS One 8: e067626. DOI: 10.1371 / journal.pone.0067626

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арренберг, А. Б., Дель Бене, Ф., и Байер, Х. (2009). Оптический контроль поведения рыбок данио с галородопсином. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106, 17968–17973. DOI: 10.1073 / pnas.02106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Атака, К., и Пиерибоне, В. А. (2002). Генетически нацеленный флуоресцентный зонд стробирования канала с быстрой кинетикой. Biophys. J. 82, 509–516. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (02) 75415-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баджар, Б. Т., Ван, Э. С., Лам, А. Дж., Ким, Б. Б., Джейкобс, К. Л., Хоу, Э. С. и др. (2016). Повышение яркости и фотостабильности зеленых и красных флуоресцентных белков для визуализации живых клеток и отчетов FRET. Sci. Rep. 6: 20889. DOI: 10.1038 / srep20889

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейкер, Б. Дж., Джин, Л., Хан, З., Коэн, Л. Б., Попович, М., Платиса, Дж. И др. (2012). Генетически закодированные флуоресцентные датчики напряжения с использованием чувствительного к напряжению домена Nematostella и данио-фосфатаз демонстрируют быструю кинетику. J. Neurosci. Методы 208, 190–196. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2012.05.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейкер, Б.J., Lee, H., Pieribone, V.A., Cohen, L.B., Isacoff, E.Y., Knopfel, T., et al. (2007). Три датчика напряжения флуоресцентных белков демонстрируют низкую экспрессию плазматической мембраны в клетках млекопитающих. J. Neurosci. Методы 161, 32–38. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2006.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барнетт, Л., Платиса, Дж., Попович, М., Пиерибоне, В. А., и Хьюз, Т. (2012). Флуоресцентный генетически закодированный зонд напряжения, способный определять потенциалы действия. PLoS One 7: e043454. DOI: 10.1371 / journal.pone.0043454

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бринкс, Д., Кляйн, А. Дж., И Коэн, А. Е. (2015). Двухфотонная визуализация напряжения за время жизни, показывающая белки как зонд абсолютного мембранного напряжения. Biophys. J. 109, 914–921. DOI: 10.1016 / j.bpj.2015.07.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цао, Г., Платиса, Дж., Пиерибоне, В. А., Раккулья, Д., Кунст, М., Нитабах, М. Н. (2013). Генетически направленная оптическая электрофизиология в интактных нервных цепях. Ячейка 154, 904–913. DOI: 10.1016 / j.cell.2013.07.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карандини М., Шимаока Д., Росси Л. Ф., Сато Т. К., Бенуччи А. и Кнопфель Т. (2015). Визуализация бодрствующей зрительной коры с помощью генетически закодированного индикатора напряжения. J. Neurosci. 35, 53–63. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0594-14.2015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чемберленд, С., Ян, Х. Х., Пан, М. М., Эванс, С. В., Гуан, С., Чаварха, М., и др. (2017). Быстрая двухфотонная визуализация динамики внутриклеточного напряжения в нейрональной ткани с генетически закодированными индикаторами. eLife 6: e25690. DOI: 10.7554 / eLife.25690

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, Q., Cichon, J., Wang, W., Qiu, L., Lee, S.J., Campbell, N.R., et al. (2012).Визуализация нервной активности с использованием трансгенных мышей Thy1-GCaMP. Нейрон 76, 297–308. DOI: 10.1016 / j.neuron.2012.07.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L., Baohan, A., et al. (2013). Сверхчувствительные флуоресцентные белки для визуализации активности нейронов. Природа 499, 295–300. DOI: 10.1038 / nature12354

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чу, Дж., Oh, Y., Sens, A., Ataie, N., Dana, H., Macklin, J. J., et al. (2016). Ярко-голубой возбуждаемый оранжевый флуоресцентный белок облегчает микроскопию с двойным излучением и улучшает визуализацию биолюминесценции in vivo. Nat. Biotechnol. 34, 760–767. DOI: 10.1038 / NBT.3550

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дана, Х., Чен, Т. В., Ху, А., Шилдс, Б. К., Го, К., Лугер, Л. Л. и др. (2014). Трансгенные мыши Thy1-GCaMP6 для визуализации популяций нейронов in vivo. PLoS One 9: e0108697. DOI: 10.1371 / journal.pone.0108697

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Денк, В., Юсте, Р., Свобода, К., и Танк, Д. В. (1996). Визуализация динамики кальция в дендритных шипах. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 372–378. DOI: 10.1016 / S0959-4388 (96) 80122-X

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Димитров Д., Хе Ю., Муто Х., Бейкер Б. Дж., Коэн Л., Акеманн В. и др. (2007). Разработка и описание усовершенствованного датчика напряжения флуоресцентного белка. PLoS One 2: e0440. DOI: 10.1371 / journal.pone.0000440

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флок, С. Т., Жак, С. Л., Уилсон, Б. К., Стар, В. М., и Ван Гемерт, М. Дж. (1992). Оптические свойства интралипида: фантомная среда для изучения распространения света. Lasers Surg. Med. 12, 510–519. DOI: 10.1002 / LSM.10510

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флусберг, Б.А., Ниммерьян, А., Кокер, Э. Д., Мукамель, Э. А., Барретто, Р. П., Ко, Т. Х. и др. (2008). Высокоскоростная миниатюрная флуоресцентная микроскопия у свободно движущихся мышей. Nat. Методы 5, 935–938. DOI: 10.1038 / nmeth.1256

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Flytzanis, N. C., Bedbrook, C. N., Chiu, H., Engqvist, M. K., Xiao, C., Chan, K. Y., et al. (2014). Варианты архаэродопсина с усиленной чувствительной к напряжению флуоресценцией в нейронах млекопитающих и Caenorhabditis elegans . Nat. Commun. 5: 4894. DOI: 10.1038 / ncomms5894

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gong, Y., Huang, C., Li, J. Z., Grewe, B.F., Zhang, Y., Eismann, S., et al. (2015). Высокоскоростная регистрация нервных импульсов у бодрствующих мышей и мух с помощью флуоресцентного датчика напряжения. Наука 350, 1361–1366. DOI: 10.1126 / science.aab0810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гонг Ю., Вагнер М. Дж., Ли, Дж. З., и Шнитцер, М. Дж. (2014). Визуализация нервных импульсов в ткани мозга с использованием датчиков напряжения белка FRET-опсина. Nat. Commun. 5: 3674. DOI: 10.1038 / ncomms4674

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Градинару В., Томпсон К. Р. и Дейссерот К. (2008). eNpHR: галородопсин natronomonas, улучшенный для оптогенетических применений. Brain Cell Biol. 36, 129–139. DOI: 10.1007 / s11068-008-9027-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Градинару, В., Zhang, F., Ramakrishnan, C., Mattis, J., Prakash, R., Diester, I., et al. (2010). Молекулярные и клеточные подходы для диверсификации и расширения оптогенетики. Ячейка 141, 154–165. DOI: 10.1016 / j.cell.2010.02.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, З., Джин, Л., Чен, Ф., Лотурко, Дж. Дж., Коэн, Л. Б., Бондарь, А., и др. (2014). Механистические исследования генетически кодируемого датчика напряжения флуоресцентного белка ArcLight. PLoS One 9: e0113873.DOI: 10.1371 / journal.pone.0113873

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, З., Джин, Л., Платиса, Дж., Коэн, Л. Б., Бейкер, Б. Дж., И Пиерибоне, В. А. (2013). Флуоресцентные датчики напряжения белка, полученные от ArcLight, которые реагируют на изменения напряжения мембраны с быстрой кинетикой. PLoS One 8: e081295. DOI: 10.1371 / journal.pone.0081295

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хохбаум, Д. Р., Чжао, Ю., Фархи, С. Л., Клапоэтке, Н., Верли, К. А., Капур, В. и др. (2014). Полностью оптическая электрофизиология нейронов млекопитающих с использованием инженерных микробных родопсинов. Nat. Методы 11, 825–833. DOI: 10,1038 / Nmeth.3000

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хубер Д., Гутниски Д. А., Перон С., О'Коннор Д. Х., Вигерт Дж. С., Тиан Л. и др. (2012). Множественные динамические представления в моторной коре во время сенсомоторного обучения. Природа 484, 473–478.DOI: 10.1038 / природа11039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джин, Л., Хан, З., Платиса, Дж., Вултортон, Дж. Р., Коэн, Л. Б., и Пиерибоне, В. А. (2012). Потенциалы одиночного действия и подпороговые электрические события, отображаемые в нейронах с помощью флуоресцентного белкового датчика напряжения. Neuron 75, 779–785. DOI: 10.1016 / j.neuron.2012.06.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джун, Дж. Дж., Стейнмец, Н. А., Siegle, J.H., Denman, D.J., Bauza, M., Barbarits, B., et al. (2017). Полностью интегрированные кремниевые зонды для записи нейронной активности с высокой плотностью записи. Природа 551, 232–236. DOI: 10.1038 / природа24636

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канг Б. Э. и Бейкер Б. Дж. (2016). Pado, флуоресцентный белок с активностью протонных каналов, может оптически контролировать мембранный потенциал, внутриклеточный pH и картировать щелевые соединения. Sci. Отчет 6: 23865.DOI: 10.1038 / srep23865

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каннан, М., Васан, Г., Хуанг, К., Хазиза, С., Ли, Дж. З., Инан, Х. и др. (2018). Быстрая визуализация напряжения in vivo с использованием красного флуоресцентного индикатора. Nat. Методы 15, 1108–1116. DOI: 10.1038 / s41592-018-0188-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Катона Г., Салай Г., Маак П., Касас А., Вереш М., Хиллиер Д. и др. (2012). Быстрая двухфотонная визуализация in vivo с трехмерным сканированием с произвольным доступом в больших объемах тканей. Nat. Методы 9, 201–208. DOI: 10.1038 / Nmeth.1851

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кляйн, М., Афонсо, Б., Воннер, А. Дж., Эрнандес-Нуньес, Л., Берк, М., Табоне, К. Дж. И др. (2015). Сенсорные детерминанты динамики поведения при термотаксисе дрозофилы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, E220 – E229. DOI: 10.1073 / pnas.1416212112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Когоут, С.К., Ульбрих, М. Х., Белл, С. С., и Исакофф, Э. Ю. (2008). Субъединичная организация и функциональные переходы в Ci-VSP. Nat. Struct. Мол. Биол. 15, 106–108. DOI: 10.1038 / nsmb1320

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ковачевич И., Ороско Дж. М. и Крам Э. Дж. (2013). Филамин и фосфолипаза С-эпсилон необходимы для передачи сигналов кальция в сперматеке Caenorhabditis elegans . PLoS Genet. 9: e1003510. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1003510

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кунст М., Хьюз М. Э., Раккулья Д., Феликс М., Ли М., Барнетт Г. и др. (2014). Связанные с геном кальцитонина пептидные нейроны опосредуют специфичный для сна циркадный выброс у дрозофилы. Curr. Биол. 24, 2652–2664. DOI: 10.1016 / j.cub.2014.09.077

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К., Вандерлинг, С., Падуч, М., Медовой, Д., Сингхарой, А., Mcgreevy, R., et al. (2014). Структурный механизм зависящего от напряжения стробирования в изолированной области измерения напряжения. Nat. Struct. Мол. Биол. 21, 244–252. DOI: 10.1038 / nsmb.2768

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Липпинкотт-Шварц, Дж., Робертс, Т. Х., и Хиршберг, К. (2000). Транспорт секреторных белков и динамика органелл в живых клетках. Annu. Rev. Cell Dev. Биол. 16, 557–589. DOI: 10.1146 / annurev.cellbio.16.1,557

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лур, Г., Винк, М. А., Танг, Л., Кардин, Дж. А., и Хигли, М. Дж. (2016). Кодирование визуальных признаков проекции кортикальными подсетями 5-го уровня. Cell Rep. 14, 2538–2545. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.02.050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Maclaurin, D., Venkatachalam, V., Lee, H., and Cohen, A.E. (2013). Механизм потенциалочувствительной флуоресценции в микробном родопсине. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 5939–5944. DOI: 10.1073 / pnas.1215595110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Майнен, З. Ф., Малинов, Р., Свобода, К. (1999). Переходные процессы синаптического кальция в отдельных шипах указывают на то, что рецепторы NMDA не насыщены. Природа 399, 151–155. DOI: 10.1038 / 20187

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маннуццу, Л. М., Моронн, М. М., и Исакофф, Э.Ю. (1996). Прямая физическая мера конформационной перестройки, лежащей в основе стробирования калиевых каналов. Наука 271, 213–216. DOI: 10.1126 / science.271.5246.213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мао, Т., О'Коннор, Д. Х., Шойс, В., Накай, Дж., И Свобода, К. (2008). Характеристика и субклеточное нацеливание на генетически кодируемые индикаторы кальция типа GCaMP. PLoS One 3: e01796. DOI: 10.1371 / journal.pone.0001796

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маршалл, Дж.Д., Ли, Дж. З., Чжан, Ю., Гонг, Ю., Сен-Пьер, Ф., Лин, М. З. и др. (2016). Оптическая запись динамики мембранного напряжения у свободно движущихся мышей в зависимости от типа клеток. Ячейка 167, 1650–1662.e15. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.11.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mittmann, W., Wallace, D. J., Czubayko, U., Herb, J. T., Schaefer, A. T., Looger, L. L., et al. (2011). Двухфотонная кальциевая визуализация вызванной активности соматосенсорных нейронов L5 in vivo. Nat. Neurosci. 14, 1089–1093. DOI: 10.1038 / nn.2879

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., Mccaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., et al. (1997). Флуоресцентные индикаторы Ca2 + на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина. Природа 388, 882–887. DOI: 10.1038 / 42264

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мукамель, Э.А., Ниммерьян, А., и Шнитцер, М.J. (2009). Автоматический анализ клеточных сигналов по данным крупномасштабной визуализации кальция. Нейрон 63, 747–760. DOI: 10.1016 / j.neuron.2009.08.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мурата, Ю., Ивасаки, Х., Сасаки, М., Инаба, К., и Окамура, Ю. (2005). Активность фосфоинозитид фосфатазы связана с датчиком внутреннего напряжения. Природа 435, 1239–1243. DOI: 10.1038 / nature03650

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нагаи Т., Ямада, С., Томинага, Т., Итикава, М., и Мияваки, А. (2004). Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) за счет циркулярно пермутированных желтых флуоресцентных белков. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101, 10554–10559. DOI: 10.1073 / pnas.0400417101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Палмер А. Е., Джакомелло М., Кортемме Т., Хайрес С. А., Лев-Рам В., Бейкер Д. и др. (2006). Индикаторы Ca2 + на основе пар кальмодулин-пептид, переработанных с помощью вычислений. Chem. Биол. 13, 521–530. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2006.03.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паркер Дж. Л. и Ньюстед С. (2016). Кристаллизация мембранных белков: современные тенденции и перспективы на будущее. Adv. Exp. Med. Биол. 922, 61–72. DOI: 10.1007 / 978-3-319-35072-1_5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перрон, А., Муто, Х., Акеман, В., Гаутам, С. Г., Димитров, Д., Iwamoto, Y., et al. (2009). Чувствительные к напряжению флуоресцентные белки второго и третьего поколения для мониторинга мембранного потенциала. Фронт. Мол. Neurosci. 2: 5. DOI: 10.3389 / нейро.02.005.2009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пяо, Х. Х., Раджакумар, Д., Кан, Б. Э., Ким, Э. Х. и Бейкер, Б. Дж. (2015). Комбинаторный мутагенез домена, чувствительного к напряжению, обеспечивает оптическое разрешение потенциалов действия, запускаемых с частотой 60 Гц, с помощью генетически закодированного флуоресцентного датчика мембранного потенциала. J. Neurosci. 35, 372–385. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3008-14.2015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пяткевич, К. Д., Хулит, Дж., Субач, О. М., Ву, Б., Абдулла, А., Сегалл, Дж. Э. и др. (2010). Мономерные красные флуоресцентные белки с большим стоксовым сдвигом. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 5369–5374. DOI: 10.1073 / pnas.05107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пяткевич, К.D., Jung, E. E., Straub, C., Linghu, C., Park, D., Suk, H. J., et al. (2018). Роботизированный подход многомерной направленной эволюции, применяемый к флуоресцентным репортерам напряжения. Nat. Chem. Биол. 14, 352–360. DOI: 10.1038 / s41589-018-0004-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пяткевич К. Д., Малашкевич В. Н., Морозова К. С., Немкович Н. А., Альмо С. С., Верхуша В. В. (2013). Расширенный стоксов сдвиг в флуоресцентных белках: взаимодействия хромофор-белок в варианте TagRFP675 в ближнем инфракрасном диапазоне. Sci. Реп. 3: 1847. DOI: 10.1038 / srep01847

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Платиса Дж., Васан Г., Янг А. и Пиерибоне В. А. (2017). Направленная эволюция ключевых остатков флуоресцентного белка меняет полярность чувствительности к напряжению в генетически кодируемом индикаторе arclight. ACS Chem. Neurosci. 8, 513–523. DOI: 10.1021 / acschemneuro.6b00234

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ромозер, В.А., Хинкль П. М. и Персечини А. (1997). Обнаружение в живых клетках Са2 + -зависимых изменений флуоресцентного излучения индикатора, состоящего из двух вариантов зеленого флуоресцентного белка, связанных кальмодулин-связывающей последовательностью. Новый класс люминесцентных индикаторов. J. Biol. Chem. 272, 13270–13274. DOI: 10.1074 / jbc.272.20.13270

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сакаи, Р., Репунте-Канониго, В., Радж, К. Д. и Кнопфель, Т. (2001). Дизайн и характеристика кодируемого ДНК, чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. Eur. J. Neurosci. 13, 2314–2318. DOI: 10.1046 / j.0953-816x.2001.01617.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Со, С. А., Сигг, Д., Папазян, Д. М., и Безанилла, Ф. (1996). Остатки измерения напряжения в сегментах S2 и S4 канала Shaker K +. Нейрон 16, 1159–1167.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Сигел, М. С., Исакофф, Э. Ю. (1997). Генетически закодированный оптический зонд мембранного напряжения. Нейрон 19, 735–741. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 80955-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стораче, Д. А., Браубах, О. Р., Джин, Л., Коэн, Л. Б., и Сунг, Ю. (2015). Мониторинг активности мозга с помощью датчиков напряжения белка и кальция. Sci. Отчет 5: 10212. DOI: 10.1038 / srep10212

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сен-Пьер, Ф., Маршалл, Дж. Д., Янг, Ю., Гонг, Ю., Шнитцер, М. Дж., И Лин, М.З. (2014). Высокоточная оптическая регистрация электрической активности нейронов с помощью сверхбыстрого флуоресцентного датчика напряжения. Nat. Neurosci. 17, 884–889. DOI: 10.1038 / nn.3709

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиан, Л., Хайрес, С. А., Лугер, Л. Л. (2012). Визуализация активности нейронов с помощью генетически закодированных кальциевых индикаторов. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 647–656. DOI: 10.1101 / pdb.top069609

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиан, Л., Hires, S.A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M.E., Chalasani, S.H., et al. (2009). Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными показателями кальция GCaMP. Nat. Методы 6, 875–881. DOI: 10.1038 / nmeth.1398

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цуцуи, Х., Карасава, С., Окамура, Ю., и Мияваки, А. (2008). Улучшение измерений мембранного напряжения с помощью FRET с новыми флуоресцентными белками. Nat. Методы 5, 683–685.DOI: 10.1038 / nmeth.1235

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вильяльба-Галеа, К. А., Сандтнер, В., Димитров, Д., Муто, Х., Кнопфель, Т., и Безанилла, Ф. (2009). Движение заряда чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. Biophys. J. 96, L19 – L21. DOI: 10.1016 / j.bpj.2008.11.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wachowiak, M., Economo, M. N., Diaz-Quesada, M., Brunert, D., Wesson, D. W., White, J.A., et al. (2013). Оптическое рассечение обработки информации об запахе in vivo с использованием GCaMPs, экспрессированных в определенных типах клеток обонятельной луковицы. J. Neurosci. 33, 5285–5300. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4824-12.2013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уилт, Б.А., Фицджеральд, Дж. Э., и Шнитцер, М. Дж. (2013). Фотонный дробовой шум ограничивает оптическое обнаружение спайков нейронов и оценку времени спайков. Biophys. J. 104, 51–62.DOI: 10.1016 / j.bpj.2012.07.058

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг Х. Х., Сен-Пьер Ф., Сан Х., Дин Х., Линь М. З. и Кландинин Т. Р. (2016). Субклеточная визуализация напряжения и сигналов кальция выявляет нейронную обработку in vivo. Ячейка 166, 245–257. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.05.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг Н., Джордж А. Л. мл. И Хорн Р. (1996). Молекулярные основы движения заряда в потенциалозависимых натриевых каналах. Нейрон 16, 113–122. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 80028-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y.F, Nakano, M., et al. (2011). Расширенная палитра генетически закодированных индикаторов Ca (2) (+). Наука 333, 1888–1891. DOI: 10.1126 / science.1208592

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу Ю., Сюй Дж., Хаусвирт В. В. и Деврис С. Х. (2014). Генетически направленное бинарное маркирование нейронов сетчатки. J. Neurosci. 34, 7845–7861. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2960-13.2014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zou, P., Zhao, Y., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Brinks, D., Werley, C. A., et al. (2014). Яркие и быстрые разноцветные репортеры напряжения через электрохромный FRET. Nat. Commun. 5: 4625. DOI: 10.1038 / ncomms5625

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Общий подход к разработке положительных индикаторов напряжения eFRET

Молекулярная биология

Гены Ace2 и HaloTag были амплифицированы из плазмиды Voltron 14 .Гены Ace1, MacQ, QuasAr3, mNeonGreen и mRuby3 были синтезированы (Integrated DNA Technologies) с оптимизацией кодонов млекопитающих 10,11,12,13,22 . Гены родопсина и репортера флуоресценции объединяли с помощью перекрывающейся ПЦР. Клонирование выполняли путем расщепления рестрикционным ферментом остова плазмиды, ПЦР-амплификации вставленных генов, изотермической сборки с последующим секвенированием по Сэнгеру для проверки последовательностей ДНК. Тег локализации сомы 23,24 (ST) был добавлен с использованием перекрывающейся ПЦР для создания версий индикаторов, нацеленных на сому (например,грамм. Позитрон-СТ). Для экспрессии в первичных культурах нейронов сенсоры клонировали в плазмиду pcDNA3.1-CAG (Invitrogen). Для экспрессии у рыбок данио Positron-ST клонировали в вектор pTol2-HuC (для паннейрональной экспрессии) и в вектор pT2-Tbait-UAS (для Gal4-зависимой экспрессии). ДНК и аминокислотные последовательности Positron, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag, QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag, Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag, Ace2_D92N_E199V-mNe, дополнительный, Ace2_D92N_E199V-mNe_D92N_E199V-mNe приведены в.2 и 11–15. Плазмиды и карты доступны в Addgene.

Культура клеток HEK 293

Пиковые клетки HEK 293 25 , которые стабильно экспрессируют NaV1.3 и Kir2.1, использовали для тестирования флуоресцентного ответа некоторых позитронных мутантов с использованием полевой стимуляции. Клетки выращивали при 37 ° C, 5% CO 2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, Генетицина (Invitrogen, 10131-027), пенициллина / стрептомицина (Invitrogen, 15140-122) и пуромицина. (Invitrogen, A11138-03).Все трансфекции и анализы проводили в клетках между 5 и 15 пассажами. Плазмиды трансфицировали с использованием фосфата кальция. После трансфекции клетки HEK высевали на 24-луночные планшеты со стеклянным дном (MaTeK) и культивировали в течение 24 часов перед визуализацией. Для мечения конструкций, содержащих HaloTag, клетки инкубировали с лигандом HaloTag, содержащим 100 нМ красителя JF, в течение 30 мин.

Первичная культура клеток нейронов

Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Исследовательского городка Джанелия Медицинского института Говарда Хьюза и Комитетом по институциональной биобезопасности.Нейроны гиппокампа, выделенные от P0 до 1 крысят Sprague-Dawley, трансфицировали плазмидами pcDNA3.1-CAG с различными индикаторами путем электропорации (Lonza, P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit) в соответствии с инструкциями производителя. После трансфекции нейроны гиппокампа высевали на 24-луночные планшеты со стеклянным дном (MaTek) или 35 мм чашки со стеклянным дном (MaTek), покрытые поли-d-лизином (Sigma). Нейроны культивировали в течение 8–12 дней в среде NbActiv4 (BrainBits). Чтобы маркировать нейроны, экспрессирующие Positron, Voltron, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag, QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag и Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag, культуры инкубировали с 20-30 мкл HaloTag по 100 нМ JF.

Микроскопия

Клеточные культуры освещали световым механизмом SPECTRA X (Lumencore) и наблюдали через масляный объектив × 40 (NA = 1,3, Nikon) на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti2. Свет возбуждения и испускания пропускали через набор фильтров FITC (475/50 нм (возбуждение), 540/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 506LP (FITC-5050A-000; Semrock)) для изображения Ace2_D92N_E199V-mNeonGreen, a настраиваемый набор фильтров (510/25 нм (возбуждение), 545/40 нм (излучение) и дихроичное зеркало 525LP (Chroma)) для изображения Voltron, Positron, Ace1_Q89D_D100N_E206V-HaloTag и Mac_Q139D_D150N_E258V-HaloTag49 с маркировкой 5258V-HaloTag49 и четырехканальный полосовой фильтр (номер набора: 89000, Chroma) с соответствующей цветовой полосой от источника света SPECTRA X для изображения QuasAr3_Q95D_h206N_E214V-HaloTag с маркировкой JF 549 , позитрон с маркировкой JF 585 и Ace2_D92N_E199y.Флуоресценцию собирали на камеру CMOS для научных исследований (ORCA-Flash 4.0, Hamamatsu) и получали с помощью HCImage Live (Hamamatsu). Для покадровой съемки изображения получали при 400–3200 Гц в зависимости от эксперимента. Буфер для визуализации (содержащий следующее (в мМ): 145 NaCl, 2,5 KCl, 10 глюкозы, 10 HEPES pH 7,4, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 ) использовали во всех экспериментах с культурами клеток.

Для обработки флуоресцентных изображений область интереса (ROI) была вручную нарисована вокруг тела нейронной клетки на изображении J, и флуоресценция была измерена путем усреднения всех пикселей в теле клетки.Необработанная кривая флуоресценции (F) - это средняя интенсивность по ROI во времени. F затем аппроксимируют экспоненциальной кривой для учета обесцвечивания. Мы рассчитали Δ F / F как F - F 0 / F 0 , где F 0 - базовый уровень флуоресценции, усредненный за одну секунду до стимуляции.

Чтобы сравнить яркость позитрона и вольтрона при мембранном потенциале покоя, мы слили mTagBFP2 26 с С-концом позитрона и вольтрона, чтобы получить плазмиды pCAG-Positron-mTagBFP2 и pCAG-Voltron-mTagBFP2.Флуоресцентные изображения получали из десяти различных лунок при трех независимых трансфекциях для каждой конструкции в первичных нейронах гиппокампа. Чтобы маркировать нейроны, экспрессирующие Voltron-mTagBFP2 и позитрон-mTagBFP2, культуры инкубировали со 100 нМ лигандом JF 525 HaloTag в течение 25 минут, затем дважды промывали буфером для визуализации, инкубируя клетки в течение 5 минут во время второй промывки. Набор фильтров EBFP2 (405/20 нм (возбуждение), 460/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 425LP (49021; Chroma)) использовался для отображения канала TagBFP2, а настраиваемый набор фильтров (510/25 нм) (возбуждение), 545/40 нм (излучение) и дихроичное зеркало 525LP (Chroma)) использовали для изображения канала JF 525 в конструкциях Voltron-mTagBFP2 и Positron-mTagBF2.Соотношение канала TagBFP2 и канала JF 525 было рассчитано с использованием программного обеспечения ImageJ.

Для сравнения фотостабильности позитрона и вольтрона при мембранном потенциале покоя мы использовали локализованные версии сомы, меченные лигандом JF 525 HaloTag. Флуоресцентные изображения (экспозиция 100 мс) получали с использованием объектива × 40 каждую секунду в течение 5 минут культур нейронов, подвергнутых непрерывному освещению 18 мВт мм -2 светоизлучающим диодом (LED) (Spectra X, Lumencore).После вычитания фона рассчитывалась средняя интенсивность на кадр и наносилась на график зависимости от времени.

Стимуляция поля в спайк-клетках HEK или культуре нейронов

Изолятор стимула (A385, World Precision Instruments) с платиновыми проволоками был использован для доставки полевых стимулов (50 В, 1 мс), чтобы вызвать выброс клеток HEK или потенциалы действия в культивируемых нейронах 27 . Стимуляцию контролировали с помощью Wavesurfer, а время синхронизировали с получением флуоресценции с помощью Wavesurfer и платы National Instruments PCIe-6353.

Чтобы измерить изменение отклика флюоресценции позитронов и вольтронов на потенциалы действия во времени, мы пометили нейроны, экспрессирующие эти индикаторы, и пометили лигандом JF 525 HaloTag и получили изображение с объективом × 40 при 400 Гц при 60 мВт мм - 2 . Мы применяли стимуляцию полевым электродом, чтобы вызвать единичный потенциал действия каждые 3 с. Отдельные нейроны были вручную сегментированы путем рисования областей интереса вокруг тела клетки. Изменение флуоресценции рассчитывали для каждого потенциала действия следа, как описано выше.

Электрофизиология в культуре первичных нейронов

В культивируемых нейронах проводились одновременные записи патч-кламп целых клеток вместе с флуоресцентной визуализацией. Записи токового зажима выполняли в буфере для визуализации: 145 NaCl, 2,5 KCl, 10 глюкозы, 10 HEPES pH 7,4, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , доведенных до 310 мОсм сахарозой при комнатной температуре. Для записи с фиксацией напряжения в буфер для визуализации добавляли 500 нМ ТТХ, чтобы заблокировать натриевые каналы, и добавляли синаптические блокаторы (10 мкМ CNQX, 10 мкМ CPP, 10 мкМ ГАБАЗИН и 1 мМ MCPG) для блокирования ионотропного глутамата, ГАМК, и метаботропные рецепторы глутамата 27 .

Пипетки-патчи были изготовлены с использованием съемника P-97 (Sutter Instruments) до сопротивления кончика 4–6 МОм. Для записи с токовыми клещами пипетки были заполнены следующим (в мМ): 130 метансульфонат калия, 10 HEPES, 5 NaCl, 1 MgCl 2 , 1 Mg-ATP, 0,4 Na-GTP, 14 трис-фосфокреатин, с поправкой на pH 7,3 с помощью КОН и доведен до 300 мОсм сахарозой. Для записи с фиксацией напряжения использовался внутренний раствор на основе цезия ((в мМ): 115 метансульфонат цезия, 10 HEPES, 5 NaF, 10 EGTA, 15 CsCl, 3.5 Mg-ATP, 3 QX-314, доведенный до pH 7,3 с помощью CsOH и доведенный до 300 мОсм с помощью сахарозы).

Записи всех клеток были сделаны с использованием усилителя EPC800 (HEKA), отфильтрованы на 10 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифрованы с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6353. Пипетки размещали с помощью манипулятора MPC200 (Sutter Instruments). Программное обеспечение Wavesurfer использовалось для генерации сигналов инжекции тока, записи кривых напряжения и тока, а также для управления камерой и источником света.Нейроны с сопротивлением доступа> 25 МОм отбрасывались. Для записи с токовыми фиксаторами для генерации потенциалов действия подавалось 20–200 пА в течение 1–2 с и контролировалось напряжение.

Для экспериментов с фиксацией напряжения, используемых для создания кривых флуоресценции-напряжения, ступеньки напряжения (от -110 мВ до +50 мВ с шагом 20 мВ в течение 1 с) применялись к клеткам, выдерживаемым при -70 мВ. Флуоресцентные изображения получали при 400 Гц с использованием того же микроскопа, который описан в разделе «Микроскопия» выше. Для определения скорости реакции индикаторов изображения флуоресценции получали при 3200 Гц в ответ на скачок напряжения 100 мВ, подаваемый на нейроны с фиксированным напряжением (от -70 мВ до +30 мВ).Следы были подогнаны к двойной экспоненциальной функции с использованием MATLAB. Все записи производились при комнатной температуре.

Измерения фототока

Фототоки регистрировались при комнатной температуре в режиме фиксации напряжения с удерживающим потенциалом -70 мВ в ответ на световые импульсы длительностью 1 с. Фототоки регистрировались с помощью усилителя EPC800 (HEKA), фильтровались на частоте 10 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифровывались с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6353 на частоте 20 кГц, управляемой с помощью WaveSurfer.Свет доставлялся к зажатым нейронам с использованием того же микроскопа, который описан выше. Освещенность в плоскости изображения была установлена ​​на 70 мВт · мм -2 , определенная с помощью датчика мощности на предметном стекле микроскопа (S170C, Thorlabs).

Визуализация у рыбок данио

Была выполнена визуализация напряжения широкого поля in vivo у рыбок данио. Вкратце, индикатор Positron-ST временно экспрессировался инъекцией pT2-Tbait-UAS-Positron-ST (25 нг мкл ДНК -1 с 25 нг мкл мРНК транспозазы -1 Tol2 в среде E3) в Tg ( elavl3: Gal4-VP16) на 1-2 клеточной стадии.JF 525 загружали инъецированным рыбам через три дня после оплодотворения (dpf) путем инкубации в 3 мкМ системном водном растворе JF 525 в течение 2 часов. Рыб с редко меченными нейронами переднего мозга парализовали α-бунгаротоксином (1 мг / мл -1 ) и помещали в агарозу с низкой температурой плавления. Спонтанную активность нейронов переднего мозга регистрировали с помощью специального широкоугольного микроскопа, оснащенного водно-иммерсионным объективом × 60 1.0 NA (MRD07620, Nikon), светодиодным источником света (CBT-90-W, Luminous) и набором фильтров TRITC ( TRITC-B-000, Semrock).Изображения получали с помощью камеры sCMOS (pco.edge 4.2, PCO) при 400 Гц в течение 1-2 мин. Энергия излучения в плоскости изображения составляла 28 мВт · мм -2 (S170C, Thorlabs).

Чтобы сравнить эффективность индикатора Positron-ST и индикатора Voltron-ST для обнаружения пиковой активности, мы сосредоточились на OSN, которые показали тоническую спонтанную пиковую активность, аналогичную той, о которой сообщалось у других видов 28,29 . JF 552 Лиганд HaloTag 30 загружали с использованием того же протокола, описанного выше, и для визуализации отбирали рыб с редко меченными OSN, чтобы минимизировать загрязнение сигналов от ближайших клеток.Используя тот же протокол визуализации, описанный выше, флуоресцентный сигнал регистрировали в течение 5 минут. Необработанный график флуоресценции отдельных OSN сначала был извлечен из вручную нарисованного ROI, а затем была рассчитана постоянная времени обесцвечивания красителя для каждого индикатора путем подгонки функции экспоненциального затухания к необработанному временному графику. Чтобы изучить процентное изменение сигнала временного спайкоподобного сигнала, базовый сигнал флуоресценции, соответствующий мембранному потенциалу покоя, был оценен по нижнему 10-му процентилю временного окна перемещения длительностью 1 с (или верхнему 10-му процентилю сигнала в случае Voltron-ST) и используется для расчета процентного изменения сигнала для пикообразного сигнала (Δ F / F 0 ).Затем спайкообразные события были идентифицированы с помощью следующей процедуры. Сначала Δ F / F 0 было преобразовано z , а затем было выполнено дискретное вейвлет-преобразование с максимальным перекрытием с использованием вейвлета sym4 до шестого уровня. Затем была реконструирована частотно-локализованная версия сигнала с использованием вейвлет-коэффициентов от уровня 3 до 6, чтобы максимизировать энергию пиково-подобного сигнала, а затем была применена его мощность для обнаружения пикового события.Эта процедура позволила нам обнаружить отчетливый пиковый сигнал независимо от его процентного изменения сигнала для обоих индикаторов с точно такой же процедурой и порогом. Мы ограничили наш анализ клетками, которые показали тоническое возбуждение в течение 5-минутного сеанса визуализации, и исследовали амплитуду (Δ F / F 0 ) и SNR ( z -балл).

Моделирование положительных и отрицательных GEVI

Для моделирования работы положительных и отрицательных индикаторов мы начали с реальной записи из поверхностной коры головного мозга мыши и добавили моделируемые нейроны, как в нашей предыдущей работе 14 .В этих симуляциях мы использовали реальную запись (40 000 кадров), содержащую один нейрон, меченный вольтроном, в качестве положительного контроля. Мы синтезировали пространственные следы для каждого нейрона. Затем мы смоделировали «следы напряжения» для каждого нейрона (дополнительный рисунок 10b), содержащие в среднем 100 импульсов на запись, и преобразовали их в положительные и отрицательные индикаторные следы в диапазоне от F мин до F . макс . Для положительных следов F мин. соответствует флуоресценции при мембранном потенциале покоя, а F макс. - средней высоте пика.Для отрицательно идущих следов F мин. соответствует средней высоте пика, а F макс. соответствует флуоресценции при мембранном потенциале покоя.

Индикаторные следы были умножены на эмпирическую кривую обесцвечивания, рассчитанную по нейрону в видео, и масштабированы до сопоставимой яркости. Записи этих модельных нейронов суммировались по нейронам, и к каждому пикселю добавлялся гауссов шум, пропорциональный сигналу. Затем эта выборочная смоделированная запись была добавлена ​​к реальной записи для создания экземпляра моделирования для анализа.

Мы моделировали визуализацию разного количества нейронов с разной индикаторной чувствительностью. Для каждого смоделированного нейрона, для которого мы оценили всплески, мы включили 5 дополнительных нейронов «не в фокусе» с размытыми пространственными следами и временно перетасованными всплесками, предназначенными для моделирования фоновых источников в реальных записях. Для различной чувствительности индикатора (Δ F / F мин ) мы держали F макс фиксированными (для имитации фиксированной максимальной яркости лиганда красителя) и варьировали F мин для получения соответствующего Δ F / F мин. .Пики были восстановлены с использованием алгоритма Spike Pursuit 14 . Мы наносим на график частоту ошибок вывода пиков, рассчитанную как 1-IoU, где IoU - это пересечение, разделенное на объединение двоичных меток пиков для наземной истины и предполагаемых пиков при смоделированной частоте визуализации 400 Гц без биннинга. Код, используемый в симуляциях, доступен на github.com/KasparP/Positron.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Улучшенные индикаторы напряжения флуоресцентного белка архаэродопсина

Abstract

Давняя цель неврологии заключалась в разработке методов визуализации динамики напряжения генетически определенных подмножеств нейронов. Оптические датчики трансмембранного напряжения могут улучшить исследования нейронной активности в различных контекстах, от отдельных нейронов, культивируемых in vitro, до популяций нейронов у бодрствующих животных. Недавние успехи определили датчики на основе архаэродопсина (Arch) как многообещающий, генетически закодированный класс флуоресцентных индикаторов напряжения, которые могут сообщать о потенциале однократного действия.Арка дикого типа демонстрирует субмиллисекундные флуоресцентные реакции на трансмембранное напряжение, но его активируемый светом протонный насос также реагирует на визуализирующее освещение. Мутант Arch (Arch-D95N) не проявляет фототока, но имеет более медленную, ~ 40 мс, реакцию на переходные процессы напряжения. Здесь мы представляем датчики напряжения, полученные из Arch, с сигналами переноса, которые усиливают их локализацию на нервной мембране. Мы также описываем мутантные датчики Arch (Arch-EEN и -EEQ), которые демонстрируют более быструю кинетику и больший динамический диапазон флуоресценции, чем Arch-D95N, и не имеют фототока при интенсивностях освещения, обычно используемых для визуализации.Мы протестировали эти датчики напряжения на предмет их точности обнаружения пиков с помощью теоретической основы обнаружения сигналов, которая учитывает экспериментально измеренный дробовой шум фотонов и формы оптических сигналов для потенциалов одиночного действия. Этот анализ показал, что за счет комбинирования мутаций последовательностей и улучшенных последовательностей трафика новые сенсоры улучшили точность обнаружения спайков почти в три раза по сравнению с Arch-D95N.

Образец цитирования: Gong Y, Li JZ, Schnitzer MJ (2013) Enhanced Archaerhodopsin Fluorescent Protein Voltage Indicators.PLoS ONE 8 (6): e66959. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959

Редактор: Филиппо Дель Бене, Институт Кюри, Франция

Поступила: 22 марта 2013 г .; Принята к печати: 13 мая 2013 г .; Опубликован: 19 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Gong et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана программой Stanford CNC, грантом Stanford BioX Interdisciplinary Initiatives Program (IIP) и исследовательским грантом Национальной академии Keck Futures Initiative (NAKFI). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Флуоресцентные белковые индикаторы трансмембранного напряжения предлагают возможность прямого отображения динамики напряжения или пиковой активности генетически определенных типов клеток [1,2].Например, оптические эксперименты с использованием таких датчиков могут исследовать биофизическую динамику отдельных нейронов или сетевую динамику нейронных ансамблей. За предыдущие десятилетия было проведено множество оптических исследований, в которых использовались чувствительные к напряжению красители для регистрации потенциалов действия или синаптических потенциалов в отдельных нейронах или популяциях нейронов [3-5]. Маломолекулярные оптические датчики напряжения могут демонстрировать существенные сигналы (Δ F / F > 10%) и микросекундную кинетику, и, таким образом, выявляют динамику нейронов в различных условиях [5,6].Сегодня существует быстрорастущий набор генетических инструментов для анализа функции нейронной цепи, и генетически закодированный индикатор напряжения станет ключевым дополнением к этому набору инструментов. Более того, постоянная долговременная экспрессия сенсорного белка откроет возможность проведения покадровых экспериментов в течение нескольких дней или недель. Существуют гибридные подходы, которые сочетают экспрессию генетически кодируемого флуоресцентного белка с добавлением экзогенной небольшой молекулы, но они требуют применения экзогенного агента перед каждым сеансом визуализации и не используются для долгосрочной визуализации [7, 8].Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы внутриклеточного [Ca 2+ ] уже играют важную роль в исследованиях нейробиологии, но во многих типах нейронов Ca 2+ визуализация плохо фиксирует динамику всплесков. Более того, визуализация Ca 2+ обычно не дает возможности исследовать подпороговую динамику напряжения или высокочастотные всплески. Подходящие генетически закодированные датчики напряжения могут помочь исследовать такие явления, и недавние работы по созданию таких датчиков развивались по многим направлениям на основе флуоресцентных белков и микробных опсинов.

Ранний генетически закодированный датчик напряжения использовал шейкер K + -канал в качестве чувствительного к напряжению домена (VSD), но последующая работа была сосредоточена на Ciona Кишечник VSD (Ci-VSD) [2,9]. Например, комбинация Ci-VSD и флуорофоров с красным смещением привела к созданию датчиков напряжения FRET (варианты VSFP2.x, VSFP-mUKG-mKOκ и VSFP-clover-mRuby) с кинетикой ~ 20-100 мс и превосходной чувствительностью по сравнению с известные датчики [10–15]. Другие сенсоры на основе pH-чувствительных GFP, GFP с круговой перестановкой и гибридных Ci-VSD доменов дали дальнейшее улучшение динамического диапазона и кинетики [16–20].Однако, несмотря на то, что сенсоры на основе Ci-VSD использовали яркие флуоресцентные белки, они еще не осознали большой динамический диапазон и быструю кинетику низкомолекулярных чувствительных к напряжению красителей (например, [3–6]). Датчики на основе Ci-VSD обычно имеют умеренный отклик (Δ F / F <3%) на потенциалы действия нейронов.

Другой недавний класс датчиков напряжения использует белки семейства родопсинов, которые содержат как чувствительный к напряжению домен, так и флуорофор.Работа над фотоциклом бактериородопсина показала, что родопсин действует как протонный насос, поглощая фотон и используя энергию для изомеризации связанного сетчатки. Последующие конформационные и электронные перестройки вызывают перенос протона изнутри клетки наружу [21,22]. Архаэродопсин-3 (Arch) структурно гомологичен бактериородопсину и качает гиперполяризационный ток при оптическом возбуждении [23].

Исходное состояние Arch, содержащего изомеризованный ретиналь и депротонированное основание Шиффа, является чувствительным к напряжению, а трансмембранное напряжение модулирует абсорбцию как в протеородопсине, так и в Arch [24,25].Это, в свою очередь, дает модуляцию слабой флуоресценции Арка. Следовательно, флуоресценция в Arch дикого типа сообщает о динамике мембранного напряжения с субмиллисекундным временем отклика. Однако одновременный фототок, создаваемый визуализирующим освещением, может изменить функцию нейронов. Мутация Arch (D95N) устранила фототок и продемонстрировала больший динамический диапазон (~ 40% на 100 мВ), но также показала медленную кинетику с временем нарастания ~ 41 мс при комнатной температуре [25]. Эти датчики напряжения дуги также относительно тусклые, демонстрируя на два-три порядка меньший квантовый выход, чем GFP.

Улучшение характеристик датчиков напряжения зависит от увеличения яркости, а также от реакции Δ F / F на активность напряжения, которые способствуют оптическому обнаружению [26]. Все датчики без фототока из класса Ci-VSD и класса Arch демонстрируют ограниченную реакцию на потенциалы действия (Δ F / F <5%), поскольку их медленное время нарастания в десятки миллисекунд не позволяет датчикам использовать преимущества. их большого (установившегося) динамического диапазона (~ 40% на 100 мВ).Таким образом, более быстрая кинетика, приводящая к увеличению Δ F / F ответов на быстрые переходные процессы напряжения, могла бы значительно улучшить перспективы использования таких генетически закодированных датчиков напряжения для визуализации потенциалов действия.

Здесь мы представляем новые флуоресцентные датчики напряжения Archaerhodopsin с более высокой кинетикой и большим динамическим диапазоном, чем Arch-D95N. Мы также показываем, что улучшенные сигналы трафика улучшают мембранную локализацию датчиков Arch, что способствует превосходному оптическому считыванию мембранного напряжения.Затем мы описываем новые мутации Arch, которые улучшают его кинетику и динамический диапазон. Используя теорию обнаружения сигналов для анализа наших экспериментальных измерений, мы показываем, что эти улучшения позволяют получить датчик, который сообщает о потенциалах действия нейронов с точностью до ~ 3 раз большей, чем у Arch-D95N, - без фототока, индуцированного визуализирующим освещением.

Результаты

Усиленные мотивы трафика улучшили локализацию арочной мембраны

В качестве первого шага в улучшении характеристик датчика напряжения мы стремились улучшить нацеливание датчика на клеточную мембрану.В первоначальном исследовании возможностей Arch в качестве датчика напряжения вычислительное взвешивание пикселей изображения было необходимо для отделения полезной флуоресцентной реакции на изменения трансмембранного потенциала от неотзывчивой фоновой флуоресценции [25]. Большая часть последней флуоресценции, вероятно, возникла из-за неправильно нацеленных молекул Arch. Используя большое оптическое увеличение и затем сильно утяжеляя пиксели на клеточной мембране, можно было в значительной степени игнорировать большинство неотзывчивых пикселей. Однако, если кто-то хочет отобразить множество клеток в широком поле зрения, эта стратегия сильного увеличения изображения каждого нейрона нецелесообразна.

Для усиления мембранной локализации Arch сенсоров мы использовали те же мотивы трафика, которые использовались ранее с широким классом ингибирующих опсинов [27,28]. Предыдущая работа показала, что экспортная последовательность эндоплазматического ретикулума (ER) (FCYENEV) и последовательность сигнала экспорта Гольджи (TS) (KSRITSEGEYIPLDQIDINV), обнаруженные в локализованных на мембране калиевых каналах Kir2.1 [29], улучшают локализацию мембраны NpHR при добавлении к соответствующие концы белка опсина. Полученные в результате улучшенные опсины имели в 3-5 раз больший фототок, чем аналоги без мотивов трафика, с меньшим количеством внутриклеточных агрегатов [27,28,30].Хотя сообщается, что др. Экспортный мотив Kir 2.1 улучшает локализацию в мембране др. Датчиков напряжения, таких как VSFP-butterfly [20], этот экспортный мотив существенно не улучшает локализацию мембраны родопсина в предыдущих исследованиях [28].

Мы создали все варианты Arch, обсуждаемые в этой статье, в аналогичной конструкции, содержащей промотор CaMKIIα ( Camk2a ) и посттранскрипционный регуляторный элемент суркового гепатита (WPRE) (рис. 1а). В нейронах, трансфицированных конструкциями, содержащими сигналы трафика, сигналы флуоресценции YFP и Arch, как правило, локализованы на мембране, что указывает на минимальную внутриклеточную агрегацию (рис. 1b).

Рис. 1. Спектры флуоресценции и мембранная локализация усиленных конструкций Arch.

( a ) Мы экспрессировали усиленные конструкции Arch (версии EEQ и EEN) в виде слияния с eYFP под контролем промотора Camk2a и направили слитый белок на клеточную мембрану с использованием последовательностей локализации TS и ER. ( b ) Сигналы флуоресценции от меченого нейрона, как видно в каналах флуоресценции YFP ( слева, ) и Arch-EEN ( в середине ), а также на нормализованной пространственной карте ( справа ) флуоресцентного ответа на ступенчатая деполяризация напряжения.Области, в которых была видна флуоресценция YFP, также обычно проявляли ответы Arch на деполяризацию напряжения, что свидетельствует об успешном нацеливании на мембрану. Масштабная линейка составляет 20 мкм. ( c ) Спектры поглощения и флуоресценции Arch-EEN. Спектры Arch-EEQ аналогичны.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g001

Мы применили протокол ступенчатого напряжения к нейронам, экспрессирующим варианты Arch, в то время как мы отслеживали эмиссию флуоресценции (методы).Чтобы качественно оценить степень локализации мембраны, мы вычислили изменения интенсивности флуоресценции Δ F / F по всем изображениям (рис. 1b). Пиксели с наибольшими значениями Δ F / F были расположены на внешних краях изображения ячейки, но мы также наблюдали значительные значения Δ F / F для пикселей внутри ячейки. Эти пиксели включали сигналы флуоресценции от частей клеточной мембраны, которые находились за пределами фокальной плоскости, но, тем не менее, улавливали флуоресцентное излучение из-за отсутствия оптических секций.Как и ожидалось, внутренние пиксели показали более низкую интенсивность излучения, но лишь умеренно более низкие значения Δ F / F , чем пиксели на внешних краях ячеек. Эти наблюдения подтверждают, что сигналы трафика улучшают локализацию мембран и снижают нечувствительную к напряжению агрегацию белков Arch в теле клетки. Учитывая эту улучшенную локализацию, мы сгруппировали пиксели до гораздо более низкого разрешения, чем в предыдущих исследованиях, ранжировали пиксели на основе их отношения сигнал / шум (SNR) и выбрали достаточное количество пикселей для покрытия сомы ячейки (методы).Такой крупнозернистый анализ совместим с исследованиями изображений в большом поле зрения, сохраняя при этом динамический диапазон экспериментально измеренных значений Δ F / F .

Мутанты Arch показали более высокую кинетику и больший динамический диапазон, чем Arch-D95N

Чтобы повысить чувствительность Arch к напряжению, мы использовали обширную литературу о том, как мутации белков влияют на фотоцикл бактериородопсина. Используя гомологию между бактериородопсином и Arch в их аминокислотных последовательностях, мы отметили, что процесс протонной перекачки перемещает протон через позиции D95, D222, E214 и D106 в Arch [31–33].Депротонирование основания Шиффа и передача заряда в положение D95 является первым этапом транслокации протона фотоцикла. Репротонирование основания Шиффа зарядом, передаваемым из позиции D106, является последним шагом [21,22]. Поскольку эти два шага являются ключевыми для модуляции зарядового состояния основания Шиффа и, следовательно, поглощения и флуоресценции, мы рассмотрели мутации в этих положениях для повышения чувствительности Арка к напряжению.

Мутация аминокислоты D95 в незаряженную аминокислоту является общим способом устранения фототока [25,31–33].Помимо вышеупомянутой мутации D95N, мутации D95S и D95T в гомологичном положении в бактериородопсине привели к току Cl -, который не принесет пользы при визуализации напряжения [34]. В недавних сообщениях мутация бактериородопсина, гомологичного D95Q, также устраняла фототок [35]. Мы исследовали эту мутацию в Arch. При экспрессии в клетках HEK эта мутация давала 50% Δ F / F на 100 мВ изменения напряжения на мембране и отсутствие фототока, но она также демонстрировала медленную кинетику со временем включения ~ 70 мс, во многом как Arch-D95N.

Мутации в положениях, гомологичных Arch-D106 в бактериородоспине, также модифицировали фотоцикл. Поскольку D106 служит донором основания Шиффа во время стадии репротонирования, замена D106 на незаряженную аминокислоту замедляет фотоцикл и снижает фототок [33]. Первоначально мы использовали мутацию D106N в Arch в надежде уменьшить фототок, но мутант продемонстрировал значительный фототок без чувствительности к напряжению (данные не показаны). Это наблюдение предполагает, что D106 является основным каналом для протонирования и депротонирования электронов чувствительного к напряжению основания Шиффа во время модуляции мембранного напряжения.Таким образом, мутация аспарагиновой кислоты в гомологичную глутаминовую кислоту может сдвигать относительную pK a между положением D106 и основанием Шиффа, изменяя кинетику протонирования и депротонирования. Эта комбинация наблюдений за позициями D95 и D106 привела нас к испытанию двойных мутаций D95N-D106E (Arch-EEN) и D95Q-D106E (Arch-EEQ).

Спектрально, два мутанта Arch (которые мы будем называть Arch-EEx, когда будем обращаться к ним обоим) похожи на Arch-D95N как по абсорбции, так и по испусканию (рис. 1c).Arch-EEx имел больший динамический диапазон, чем Arch-D95N, в ответ на различные формы сигналов напряжения и тока (методы). Сначала мы сравнили ступенчатую реакцию Arch-D95N, Arch-EEN и Arch-EEQ в нейронах при низкой частоте кадров 440 Гц (рис. 2а). Затем мы исследовали начальный рост оптической волны каждого мутанта путем визуализации с высокой частотой кадров (1000 Гц) флуоресцентной реакции на деполяризацию напряжения от -70 мВ до +30 мВ (рис. 2b). Мутация D106E дала быструю кинетику как для мутаций D95N, так и для D95Q, что привело к времени нарастания ~ 5-15 мс с точностью до 1/ e от полного ответа по сравнению с ~ 45 мс для Arch-D95N (методы).Мы также наблюдали быстрый компонент роста флуоресценции как для Arch-EEN, так и для Arch-EEQ. Этот быстрый компонент улучшил Δ F / F в ответ на потенциалы действия, как описано ниже. Мы усреднили установившееся состояние Δ F / F как функцию приложенного напряжения (рис. 2c) и обнаружили, что Arch-EEQ превзошел Arch-D95N, достигнув 60% Δ F / F на 100 мВ. Arch-EEN уступал Arch-D95N в этом отношении, давая только 20% Δ F / F на шаг напряжения 100 мВ.

Рис. 2. Варианты Enhanced Arch быстрее и с большим динамическим диапазоном реагируют на деполяризацию напряжения.

( a ) Оптические ступенчатые ответы нейронов, трансфицированных Arch-D95N, Arch-EEN и Arch-EEQ, отображаемые с частотой 440 Гц. Мы удерживали нейроны на уровне -70 мВ в начале каждой кривой и переходили к командному напряжению в диапазоне от -140 мВ до +100 мВ. ( b ) Оптическая ступенчатая реакция конструкций Arch, выраженная в нейронах при повышении напряжения с -70 мВ до +30 мВ, нормализованная к максимальной ступенчатой ​​реакции каждого датчика и отображаемая в более коротких временных масштабах, чем в ( a ), отображаемая на 1000 Гц.( c ) Устойчивый флуоресцентный ответ конструкций Arch как функция мембранного напряжения. ( d ) Arch-WT генерировал заметный фототок при освещении 633 нм (пурпурные полосы), тогда как Arch-EEQ генерировал незначительный фототок. ( e ) Устойчивые фототоки различных конструкций Arch в ответ на одно и то же освещение 633 нм. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего (s.e.m). Интенсивность освещения на образце составила 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g002

Поскольку Arch дикого типа генерирует тормозящий фототок, который изменяет функцию нейрона, мы также проверили, производят ли новые мутанты какой-либо фототок. Мы наблюдали значительный фототок для нейрона, трансфицированного Arch дикого типа во время применения возбуждающего лазера при той же интенсивности освещения (1400 мВт / мм 2 ), используемой во время визуализации (рис. 2d). Однако в идентичных оптических условиях мы зарегистрировали небольшой фототок для нейрона, трансфицированного Arch-EEQ.Усредняя измеренный фототок по многим ячейкам, мы наблюдали незначительный фототок для Arch-EEN (-0,1 пА ± 0,1 пА, n = 10 ячеек) и Arch-EEQ (0,2 пА ± 0,1 пА, n = 16 ячеек. ) (Рис. 2д).

Более быстрая кинетика мутантов Arch-EEx также улучшила флуоресцентные ответы на потенциалы действия нейронов. Типичные оптические кривые (частота кадров 440 Гц) хорошо соответствовали одновременно зарегистрированным следам электрической активности в отношении как пиков, так и подпороговой динамики (рис. 3а).Примечательно, что компоненты быстрого и медленного отклика датчиков Arch-EEx выполняли разные функции. Быстрый компонент облегчает обнаружение пиков, тогда как комбинация быстрого и медленного компонентов передает колебания базового напряжения. Мы вычислили Δ F / F отдельных нейронов в ответ на одиночные потенциалы действия, индуцированные короткими токами инъекции (рис. 3b-c). Электрофизиологические записи для клеток, экспрессирующих Arch-EEQ, -EEN и -D95N, соответственно, показали ширину потенциала действия на полувысоте 3.5 ± 0,8 мс, 3,4 ± 0,6 мс и 3,1 ± 0,8 мс (среднее ± стандартное отклонение; n = 7–23 клетки) (рис. 3b), которые являются типичными значениями для культивируемых нейронов. Из-за своей более быстрой кинетики Arch-EEN показал ~ 3-кратное увеличение пика Δ F / F в ответ на нервные спайки по сравнению с Arch-D95N, несмотря на уменьшенный динамический диапазон Arch-EEN в установившемся состоянии. Точно так же Arch-EEQ имел 4-кратное увеличение пикового ответа Δ F / F на спайки по сравнению с Arch-D95N, со значениями Δ F / F до 17% для отдельных клеток.Вероятно, что улучшенный выбор пикселей и вычитание фона могут дать еще более высокие значения Δ F / F .

Рис. 3. Датчики Enhanced Arch сообщают о потенциалах одиночного действия с большей пиковой амплитудой, чем Arch D95N.

( a ) Следы флуоресценции нейрона, экспрессирующего Arch-EEQ ( вверху, ), и нейрона, экспрессирующего Arch-EEN ( внизу, ), показали острые пики, соответствующие потенциалам действия при одновременных электрофизиологических измерениях.( b ) Средние формы оптических сигналов (среднее значение n = 20, 20 и 12 кривых для кривых EEQ, EEN и D95N, соответственно) отклика датчиков Arch ( верхнее ) имели аналогичную форму усредненная форма электрического сигнала отдельных потенциалов действия ( внизу, n = 20 кривых). ( c ) Средние пиковые ответы на единичные потенциалы действия для Arch-D95N ( n = 7 клеток), Arch-EEN ( n = 20 клеток) и Arch-EEQ ( n = 23 клетки).Планки погрешностей - s.e.m. Частота визуализации флуоресценции составляла 440 Гц, а интенсивность освещения составляла 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g003

Мутации дуги улучшили точность обнаружения спайков

Мы охарактеризовали новые мутанты Arch, используя различные меры SNR и возможности обнаружения спайков, и обнаружили, что датчики превзошли Arch-D95N. Упрощенное понятие SNR - это пиковый отклик, деленный на стандартное отклонение базовой флуоресценции в одном временном интервале (методы).Мы сравнили ограниченные дробовым шумом характеристики различных датчиков, используя этот показатель, все в одних и тех же условиях визуализации (частота кадров 440 Гц; освещение 1400 мВт / мм 2 ) (рис. 4a). Из-за одинаковой яркости всех трех мутантов при возбуждении 633 нм, новые мутанты Arch имели аналогичное увеличение отношения сигнал / шум, как это было предсказано по увеличению ответов пика Δ F / F .

Рис. 4. Датчики Enhanced Arch превзошли Arch-D95N по нескольким параметрам, характеризующим обнаружение нейрональных спайков.

( a ) Пик Δ F / F значений оптических откликов на потенциалы действия, построенных как функция средней скорости излучения фотонов (F 0 ) в течение базовых периодов, как определено из экспериментальных форм оптических сигналов . Пунктирные линии представляют собой изоконтуры отношения сигнал / шум во время пика излучения, определяемого как отношение пиковой характеристики к стандартным отклонениям в базовом дробовом шуме, (ΔF / F) × F0 / ν. Arch-EEQ превзошел Arch-D95N примерно в 4 раза, а Arch-EEN превзошел Arch-D95N примерно в 3 раза.( b ) Пик Δ F / F значений оптических откликов на потенциалы действия, нанесенных на график как функция расчетного общего числа фотонов, детектированных на спайк. Пунктирные линии представляют собой изоконтуры точности обнаружения спайков, d ’, как определено в Wilt et al. 2012 и определено на основе экспериментально измеренных форм оптических сигналов. Arch-EEQ превзошел Arch-D95N примерно в 2,8 раза. ( c ) Усовершенствованные датчики Arch позволили увеличить продолжительность экспериментальной визуализации сверх минимальных значений точности обнаружения.Для экспериментов, которые начинаются с начального значения d ’, сплошными линиями показано общее время визуализации ( T ), которое датчики могут обеспечить точность обнаружения пиков> d / e . Для показанного начального значения d ’, Arch-EEQ обеспечил общую длительность визуализации на порядок больше, чем у Arch-D95N. Мы получили все данные изображений при частоте кадров ν = 440 Гц и интенсивности освещения 1400 мВт / мм 2 . Все точки данных представляют собой среднее значение ± s.Эм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g004

Мы также использовали теоретическую основу обнаружения сигналов для количественной оценки точности обнаружения всплесков [26]. Дискриминируемость спайков, описанная в [5]. 26, обозначенная здесь как d ', индексирует кривую рабочей характеристики приемника (ROC) для обнаружения пиков и количественно определяет степень, в которой пики могут быть правильно идентифицированы в данных флуоресценции, достигаемых в пределах физического шума, установленного дробовым шумом фотонов (методы ).Этот показатель качества учитывает экспериментально определенный базовый уровень флуоресценции нейрона, пик Δ F / F , ответ на спайк, и временную продолжительность реакции сенсора на спайк. Агрегируя фотоны по нескольким кадрам и учитывая кинетику сенсора, эта структура обеспечивает гораздо более реалистичную меру точности обнаружения пиков, чем более традиционные, упрощенные измерения SNR, такие как показанные на рис. 4a .

Чтобы сравнить различимость спайков, мы объединили на одном графике изоконтуры d ’, значений Δ F / F датчиков и общего количества фотонов, агрегированных во флуоресцентном переходном процессе (рис. 4b).Несмотря на меньшее пиковое значение Δ F / F Arch-D95N, медленная кинетика Arch-D95N обеспечила частичную компенсацию при сравнении его значения d ’ с таковыми у Arch-EEx; Более медленная кинетика Arch-D95N приводила к более длительным переходным процессам, которые увеличивали общее количество фотонов, связанных с потенциалами действия. Однако Arch-EEQ и Arch-EEN по-прежнему превосходили Arch-D95N в 2,8 и 2,0 раза при d ’соответственно.

Еще один способ оценить эффективность датчиков напряжения - сравнить общую продолжительность, в течение которой они позволяют надежно обнаруживать всплески напряжения, прежде чем подвергнуться фотообесцвечиванию.Мы определили эту продолжительность, T , для различных датчиков Arch, исследуя кинетику фотообесцвечивания (рис. 4c) (методы). Увеличение интенсивности освещения улучшает d ’ за счет увеличения скорости испускания фотонов, но также снижает T за счет ускорения фотообесцвечивания. Мы охарактеризовали этот компромисс между d ’ и T при различной интенсивности освещения, определив постоянную« фотонную емкость »для каждого датчика как произведение времени фотообесцвечивания датчика и начальной скорости испускания фотонов (рис. 4c).Поскольку d ’ пропорционально пику Δ F / F , любое улучшение последнего может привести к соответствующему увеличению в процентах T , если уменьшить интенсивность освещения для достижения фиксированного значения d’ . Значение T для Arch-EEQ было на порядок больше, чем для Arch-D95N, при любом фиксированном d ’ (рис. 4c).

Arch совместим с мультиспектральным возбуждением и формированием изображений

Спектр поглощения и флуоресценции Arch со смещением в красную область был совместим с одновременным возбуждением других белков голубым или зеленым светом.Мы использовали линкер 2A, который позволяет двум частям бицистронной последовательности экспрессироваться как отдельные молекулы белка, нарушая трансляцию белка в положении линкера 2A [36,37]. Этот подход позволил нам экспрессировать Arch-EEQ вместе с другим представляющим интерес белком в том же наборе клеток. Полипептидные линкеры и последовательности IRES также обеспечивают экспрессию двух белков с использованием только одной конструкции в слитых или разделенных формах. Однако линкер 2A обеспечивает стехиометрическую экспрессию, но различные паттерны локализации для двух видов белков, поскольку каждый белок сохраняет свои собственные мотивы переноса [36,37].В качестве иллюстраций, используя саморасщепляющийся линкер p2A, мы создали конструкции, которые одновременно экспрессируют Arch с ChR2 [38] и GCaMP5 [39]. Предыдущие работы показали, что конструкция NpHR-2A-ChR2 дает как значительный возбуждающий, так и тормозной ток, в зависимости от длины волны возбуждения, и что множественные мембранные белки могут экспрессироваться в одной клетке [28].

Во-первых, мы сделали конструкцию Arch-EEQ-2A-hChR2, чтобы обеспечить одновременный оптический контроль и считывание нейронного напряжения (рис. 5а). При таком же освещении, как указано выше, мы одновременно визуализировали датчик Arch (возбуждение 633 нм; 1400 мВт / мм 2 ) и деполяризовали нейрон (голубые полосы; возбуждение 488 нм; 4 мВт / мм 2 ) (Рисунок 5b).Электрические записи подтвердили, что во время стимуляции голубым цветом возникали потенциалы действия. Во-вторых, мы создали конструкцию Arch-EEQ-2A-GCaMP5 для одновременного считывания напряжения нейрона и динамики кальция (рис. 5c). Arch был локализован на мембране, тогда как экспрессия GCaMP5 была цитозольной, как и ожидалось с этой конструкцией (рис. 5d). Этот сегрегированный образец локализации может облегчить разделение сигналов от двух каналов флуоресценции. Мы запускали потенциалы действия, вводя короткие импульсы тока, и одновременно наблюдали за последующим напряжением и динамикой кальция (рис. 5e).Поскольку некоторые из импульсов тока не инициировали потенциалы действия, они вызывали только подпороговую деполяризацию напряжения в мембранном потенциале (методы). Кривая флуоресценции Arch сообщала об этих подпороговых событиях (оранжевые маркеры), а кривая флуоресценции GCaMP5 - нет.

Рис. 5. Бицистронные конструкции, экспрессирующие Arch-EEQ с ChR2 или GCaMP5 с включенной визуализацией напряжения в сочетании с оптогенетическим контролем или визуализацией кальция.

( a ) Схема конструкции Arch-2A-hChR2.( b ) Конструкция Arch-2A-hChR2 обеспечивала полностью оптическую стимуляцию и считывание нейронов. Мы визуализировали нейроны, трансфицированные конструкцией Arch-2A-hChR2, и одновременно измеряли трансмембранный потенциал (черный график) и флуоресценцию Arch (синий график). Фотовозбуждение ChR2 (горизонтальные голубые полосы; λ = 488 нм, 4 мВт / мм 2 ) вызывало всплески как в оптических, так и в электрических измерениях. ( c ) Схема конструкции Arch-2A-GCaMP5. ( d ) Мы наблюдали нейроны, трансфицированные конструкцией Arch-2A-GCaMP5, путем одновременной визуализации флуоресценции GCaMP5 (зеленый канал, локализованный цитозоль) и флуоресценции Arch (красный канал, локализованная мембрана).Масштабная линейка составляет 20 мкм. ( e ) Конструкция Arch-2A-GCaMP5 позволяла одновременно измерять напряжение (синий график) и внутриклеточный кальций (зеленый график). Хотя потенциалы действия были очевидны как в сигналах Arch, так и в сигналах GCaMP5 (черные треугольные маркеры на кривой GCaMP5; λ = 488 нм возбуждение, I = 10 мВт / мм 2 ), сигналы Arch были намного лучше в представлении кратких, суб -пороговая деполяризации (оранжевые кружки на следе дуги). Частота визуализации флуоресценции составляла 440 Гц, а интенсивность освещения для возбуждения дуги (возбуждение λ = 633 нм) составляла 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g005

Обсуждение

Мы представили датчик напряжения Arch, который превосходит ранее опубликованную версию в 2,8 раза в d ’. Прямое сравнение с другими классами генетически закодированных датчиков напряжения (в основном на основе вариантов GFP) затруднено, поскольку каждый класс датчиков имеет разные длины волн возбуждения и излучения и испытывается при разных уровнях мощности возбуждения.Эти три фактора влияют на уровень фоновой флуоресценции, оптического рассеяния и фототоксичности, которые являются важными параметрами, которые следует учитывать при использовании датчиков напряжения в срезах мозга и препаратах живых животных.

Хотя датчики напряжения, основанные на Ci-VSD, демонстрируют большие установившиеся значения Δ F / F (40% на 100 мВ), медленное время нарастания ограничивает оптические отклики на пики до ~ 3% изменений флуоресценции. В срезах мозга и in vivo препаратах фоновая и аутофлуоресцентная эмиссия гораздо более значительны, чем в культивируемых нейронах, вызывая дальнейшую деградацию используемых сигналов.Мощность возбуждения в десятки мВт / мм 2 необходима для обнаружения всплесков с d ’> 10, что приводит к серьезным компромиссам между наличием достаточного сигнала и предотвращением фотообесцвечивания. Поскольку датчики напряжения на основе Ci-VSD обычно уже имеют флуорофоры с высоким квантовым выходом (> 10%), прикрепленные к VSD, вероятно, что для этого класса датчиков потребуется улучшение эффективного пика Δ F / F . улучшить визуализацию напряжения одиночных спайков в срезе мозга или in vivo , либо за счет улучшения SNR, либо за счет уменьшения необходимых уровней освещенности.

Для сравнения, Arch страдает низким квантовым выходом, но имеет значительный пиковый отклик Δ F / F . Плотности мощности возбуждения, используемые здесь с Arch, позволяют проводить исследования отдельных клеток в культуре, но не позволяют легко получить широкопольное флуоресцентное изображение в срезах мозга, для которых высокая интенсивность освещения, вероятно, приведет к значительной фоновой автофлуоресценции. Фактически, исследования с использованием электропорации in utero с использованием конструкций Arch уже показали, что сигналы флуоресценции были незначительными по сравнению с фоновой автофлуоресценцией [2].Таким образом, исследователи должны улучшить низкий квантовый выход Arch, либо путем прямой мутации хромофора Arch, либо с помощью косвенных подходов, таких как использование возбуждения FRET. Независимо от эмиссионных свойств Arch, мы показали, что Arch обнаруживает переходные процессы напряжения с относительно большим динамическим диапазоном и быстрой кинетикой по сравнению с существующими датчиками напряжения флуоресцентных белков и, таким образом, служит жизнеспособной альтернативой Ci-VSD в качестве домена, чувствительного к напряжению.

Датчики напряжения, вероятно, будут играть иную роль, чем датчики кальция в нейробиологических исследованиях.Самые последние генетически закодированные сенсоры кальция приближаются к надежной чувствительности к единичным пикам, хотя их медленная кинетика ограничивает их обнаружением временно разреженных потенциалов действия [39]. Тем не менее, этой формы обнаружения спайков может быть достаточно для изучения динамики редких спайков важных классов клеток, таких как пирамидные нейроны неокортекса. Генетически закодированные датчики напряжения могут найти нишевые приложения при изучении динамики быстрых всплесков, подпороговых или популяционных уровней в генетически определенных типах нейронов, все из которых датчики кальция плохо сообщают [40].Многие нейронные сети содержат тормозящие нейроны с быстрым выбросом, которые регулируют подпороговые напряжения других клеток, что приводит к богатым классам колебательной активности. Как показали наши одновременные исследования напряжения и визуализации кальция, датчики напряжения с достаточно быстрой кинетикой (время нарастания <10 мс) и большим Δ F / F (50% на 100 мВ) могут обнаруживать подпороговую активность, которую упускает кальций. датчики. Таким образом, визуализация быстрых всплесков и подпороговой динамики с использованием датчиков напряжения нового поколения может способствовать пониманию возбуждающе-тормозного баланса и колебательных явлений в сетях.

Методы

Заявление об этике

Административная комиссия Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными (APLAC) одобрила все эксперименты на животных.

Арочные конструкции

Arch мутантов произошли от Arch-GFP (плазмида Addgene 22217). Мы сконструировали Arch-EEN, Arch-EEQ и улучшили Arch-D95N с помощью сайт-направленного мутагенеза в Arch и последующей сборки перекрытия с eYFP и сигналами трафика. Мы удалили часть eYFP конструкции Arch-EEQ при создании конструкций Arch-2A.Варианты Arch депонированы на Addgene в виде плазмид 45188 (Arch-EEQ) и 45189 (Arch-EEN).

Первичная культура клеток

Мы препарировали клетки гиппокампа крыс от детенышей Sprague-Dawley (постнатальный день 0, Charles-River Labs) и культивировали их в нейробазальной среде (Invitrogen) с добавлением глутамина и B27 (Invitrogen) [41]. Мы трансфицировали мутантную плазмидную ДНК Arch с использованием фосфата кальция через 3–5 дней после посева и визуализировали нейроны через 3–5 дней после трансфекции.

Электрофизиология

Мы одновременно получили измерения флуоресценции и измерения напряжения или тока при 22 ° C, удерживая нейроны в перфузионной камере, установленной на предметном столике микроскопа. Внеклеточный раствор содержал 150 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl 2 и 2 мМ MgCl 2 . Внутриклеточный раствор содержал 129 мМ K-глюконат, 10 мМ KCl, 10 мМ HEPES и 4 мМ Na 2 АТФ.Мы вытащили патч-пипетки из боросиликатного стекла с сопротивлением 3-6 МОм (Sutter Instruments P-97), что обеспечило сопротивление доступа 5-25 МОм в режиме целой ячейки.

Мы пропатчили нейроны с помощью усилителя Axopatch 700B (Axon Instruments) и использовали программное обеспечение pClamp (Axon Instruments) для генерации различных сигналов управления и записи кривых напряжения и тока. В форме сигнала управления напряжением применялся удерживающий потенциал -70 мВ в начале каждого цикла, а затем применялись шаги продолжительностью 1 с к напряжениям в диапазоне от -140 мВ до +100 мВ с шагом 20 мВ.Для создания потенциалов действия в токовых клещах мы подавали ток как с использованием длинных импульсов (10–200 пА;> 0,5 с), так и коротких импульсов (300-1000 пА; 2 мс). Короткие импульсы тока вызывали выбросы с эффективностью, близкой к единице, при настройке выше порога выброса и запускали выбросы с эффективностью ~ 50%, когда он приближался к порогу выброса. Мы скорректировали post hoc напряжение мембраны на потенциал перехода и сопротивление доступа.

Флуоресцентная визуализация

Мы использовали эпифлуоресцентный микроскоп (Olympus IX51) с 40 × 0.Водный иммерсионный объектив 8 NA для покадровой съемки. Мы использовали светодиод с длиной волны 480 нм (89 North Heliophore) или гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм; эти источники прошли через фильтр возбуждения 475/25 нм или 620/40 нм для возбуждения GFP / GCaMP / YFP и Arch соответственно. Мы визуализировали все следы флуоресценции Arch, используя освещение 1400 мВт / мм 2 в плоскости образца. Эмиссия флуоресценции проходила через дихроичное зеркало 495 нм и фильтр длиннопроходной эмиссии для визуализации GFP / GCaMP / YFP, но через дихроичное зеркало 645 нм и эмиссионный фильтр 697/75 нм для Arch.В экспериментах с двумя цветами использовались четырехдиапазонный фильтр возбуждения 405/488/561/635 нм (Semrock) и делитель излучения DualView (Optical Insights). Последний разделяет зеленое излучение и излучение дуги с помощью дихроичного зеркала 565 нм; два результирующих канала флуоресценции имели фильтры излучения 535/50 нм и 697/75 нм соответственно. Камера устройства с электронным умножением и зарядовой связью Andor iXon 897, охлаждаемая до -80 ° C, записывала излучение на частоте 400–1000 Гц с использованием разделенных пикселей размером 3 мкм × 3 мкм (или больше) в плоскости изображения для достижения скорости получения изображения. .

Определение карт ΔF / F

Мы вычислили Δ F / F карт как разницу между средней флуоресценцией с приложенным скачком напряжения и без него для каждого пикселя. Мы ранжировали пиксели в соответствии с их SNR, определенным здесь как (ΔF / F) × F¯, где Δ F / F - это изменение нормализованной флуоресценции при приложении шага напряжения, а F¯ - средняя флуоресценция пикселя для весь след. Затем мы суммировали флуоресценцию от верхних 20% пикселей изображения, чтобы получить временные кривые флуоресценции для дальнейшего анализа.Этого подмножества пикселей было достаточно, чтобы покрыть сому клетки.

Спектры поглощения и излучения

Мы получили спектры поглощения и излучения путем переноса мутантов Arch в плазмиды с промотором CMV и трансфекции клеток HEK в общем объеме 100 мл в течение 3 дней. Мы добавили полностью транс-ретиналь (5 мкМ) и культивировали клетки в темноте в течение 3 часов. Мы осаждали клетки, лизировали их с помощью ультразвукового устройства в 50 мМ Трис с 2 мМ MgCl 2 при pH 7,3 и снова осаждали.Наконец, мы гомогенизировали лизат в PBS (pH 7,2) с добавлением 1,5% додецилмальтоида и еще раз осаждали. Спектр поглощения был получен с использованием супернатанта и спектрофотометра (Tecan Safire 2 UV – Vis). Мы получили спектр излучения, используя ту же самую установку визуализации для экспериментов с заплатами, спектрометр (Thorlabs CCS200) и возбуждение 633 нм.

Определение скорости фотообесцвечивания и фотонной емкости

Мы повторно использовали те же самые следы в экспериментах с патч-зажимом для определения количества фотонов и времени затухания обесцвечивания, из которых мы вычислили общее количество фотонов, испускаемых клеткой до фотообесцвечивания.Выполнив экспоненциальную подгонку к периодам покоя на следах флуоресценции без электрофизиологических манипуляций, мы определили постоянную времени фотообесцвечивания для каждого следа. Мы рассчитали фотонную емкость как произведение начальной скорости испускания фотонов и времени фотообесцвечивания (9).

Определение точности обнаружения всплесков

Поскольку мы отображали все образцы Arch с одинаковой интенсивностью освещения ( I = 1400 мВт / мм 2 ), мы смогли напрямую сравнить скорости излучения фотонов различных датчиков.Сначала мы определили SNR для обнаружения пиков в оптической трассе, ограниченной дробовым шумом, как SNR = (ΔF / F) × F0 / ν, где F 0 - скорость излучения фотонов для нейрона, а ν - частота дискретизации данных. . Этот SNR представляет собой пиковый отклик Δ F , деленный на стандартное отклонение базовой линии (F0 / ν). Мы также вычислили изоконтуры отношения сигнал / шум, используя это соотношение.

Кроме того, мы использовали структуру обнаружения сигналов для вычисления параметра различимости пиков, d ’(20).Это характеризует точность обнаружения пиков сенсора таким образом, чтобы учитывать как продолжительность, так и интенсивность сигнала флуоресценции в ответ на потенциалы действия. Мы использовали экспериментальные определения средней интенсивности флуоресценции и средней формы волны флуоресценции в ответ на единичные потенциалы действия (например, рисунок 3b) для вычисления d ’. Мы вычислили изоконтуры d ', аппроксимируя переходные процессы флуоресценции как моноэкспоненциальные затухания и вычислив начальное значение d' из Δ F / F и предполагаемое общее количество фотонов в переходном процессе (20 ).Для экспериментов с начальным значением d ’мы определили время визуализации ( T ) как общую экспериментальную продолжительность, в течение которой датчик обеспечивает точность обнаружения пиков> d / e .

Благодарности

Авторы благодарят Янпин Чжан за помощь с протоколом экстракции белка и Эми Лам из лаборатории Майкла Линя за помощь в проведении спектроскопических измерений.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: YG MJS.Проведены эксперименты: Ю.Г. Проанализированы данные: Ю.Г. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YG JZL. Написал рукопись: YG JZL MJS. Готовые конструкции датчика: YG JZL.

Ссылки

  1. 1. Петерка Д.С., Такахаши Х., Юсте Р. (2011) Напряжение изображения в нейронах. Нейрон 69: 9–21. DOI: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2010.12.010. PubMed: 21220095.
  2. 2. Mutoh H, Akemann W, Knöpfel T (2012) Генетически сконструированные флуоресцентные репортеры напряжения.Acs Chem Neurosci 3: 585-592. DOI: https: //doi.org/10.1021/cn300041b. PubMed: 22896802.
  3. 3. Гринвальд А., Хильдесхайм Р. (2004) VSDI: новая эра в функциональной визуализации корковой динамики. Nat Rev Neuro 5: 874-885. DOI: https: //doi.org/10.1038/nrn1536. PubMed: 15496865.
  4. 4. Chemla S, Chavane F (2010) Визуализация чувствительного к напряжению красителя: обзор техники и модели. Журнал Физиол Париж 104: 40-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jphysparis.2009.11.009. PubMed: 19

    9.

  5. 5. Зальцберг Б.М., Гринвальд А., Коэн Л. Б., Давила Х. В., Росс В. Н. (1977) Оптическая запись нейронной активности в центральной нервной системе беспозвоночных: одновременный мониторинг нескольких нейронов. J Neurophysiol 40: 1281-1291. PubMed: 925730.
  6. 6. Зальцберг Б.М., Обейд А.Л., Безанилла Ф. (1993) Микросекундный отклик мероцианинового красителя, чувствительного к напряжению: быстрые измерения с помощью зажима напряжения на аксоне гигантского кальмара. Japn J Physiol 43: Suppl. 1: S37-S41.
  7. 7.Чанда Б., Бланк Р., Фариа Л.К., Швейцер Ф.Е., Моди I и др. (2005) Гибридный подход к измерению электрической активности генетически определенных нейронов. Nat Neurosci 8: 1619–1626. DOI: https: //doi.org/10.1038/nn1558. PubMed: 16205716.
  8. 8. Sjulson L, Miesenböck G (2008) Рациональная оптимизация и визуализация in vivo генетически закодированного репортера оптического напряжения. J Neurosci 28: 5582–5593. DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0055-08.2008. PubMed: 18495892.
  9. 9.Siegel MS, Isacoff EY (1997) Генетически закодированный оптический зонд мембранного напряжения. Нейрон 19: 735–741. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0896-6273 (00) 80955-1. PubMed: 9354320.
  10. 10. Sakai R, Repunte-Canonigo V, Raj CD, Knöpfel T (2001) Дизайн и характеристика кодируемого ДНК, чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. Eur J Neurosci 13: 2314–2318. DOI: https: //doi.org/10.1046/j.0953-816x.2001.01617.x. PubMed: 11454036.
  11. 11. Lundby A, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W, Knöpfel T (2008) Разработка генетически кодируемого флуоресцентного датчика напряжения, использующего быстрые движения Ci-VSP, чувствительные к напряжению.PLOS ONE 3: e2514. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0002514. PubMed: 18575613.
  12. 12. Lundby A, Akemann W, Knöpfel T (2010) Биофизическая характеристика флуоресцентного протеинового зонда напряжения VSFP2.3 на основе чувствительного к напряжению домена Ci-VSP. Eur Biophys J 39: 1625–1635. DOI: https: //doi.org/10.1007/s00249-010-0620-0. PubMed: 20686764.
  13. 13. Муто Х., Перрон А., Димитров Д., Ивамото Ю., Акеманн В. и др. (2009) Спектрально-разрешенные характеристики отклика трех наиболее продвинутых датчиков напряжения флуоресцентных белков на основе FRET.PLOS ONE 4: e4555. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0004555. PubMed: 1
    05.
  14. 14. Tsutsui H, Karasawa S, Okamura Y, Miyawaki A (2008) Улучшение измерений мембранного напряжения с помощью FRET с новыми флуоресцентными белками. Нат методы 5: 683–685. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1235. PubMed: 18622396.
  15. 15. Лам AJ, St-Pierre F, Gong Y, Marshall JD, Cranfill PJ et al. (2012) Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков.Нат методы 9: 1005–1012. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.2171. PubMed: 22961245.
  16. 16. Джин Л., Хан З., Платиса Дж., Вултортон Дж. Р., Коэн Л. Б. и др. (2012) Потенциалы однократного действия и подпороговые электрические события, отображаемые в нейронах с помощью флуоресцентного белкового датчика напряжения. Нейрон 75: 779–785. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.neuron.2012.06.040. PubMed: 22958819.
  17. 17. Барнетт Л., Платиса Дж., Попович М., Пиерибоне В.А., Хьюз Т. (2012) Флуоресцентный генетически закодированный пробник напряжения, способный определять потенциалы действия.PLOS ONE 7: e43454. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0043454. PubMed: 22970127.
  18. 18. Perron A, Mutoh H, Launey T, Knöpfel T (2009) Флуоресцентные белки, чувствительные к красному смещению. Chem. Биол. 16: 1268–1277.
  19. 19. Мишина Ю., Муто Х., Кнёпфель Т. (2012) Перенос функций датчика напряжения Kv3.1 в изолированную область измерения напряжения Ci-VSP. Biophys J 103: 669–676. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.031. PubMed: 22947928.
  20. 20.Akemann W, Mutoh H, Perron A, Park YK, Iwamoto Y, Knöpfel T (2012) Отображение динамики нейронной цепи с помощью чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. J Neurophysiol 108: 2323-2337. DOI: https: //doi.org/10.1152/jn.00452.2012. PubMed: 22815406.
  21. 21. Lanyi JK (2004) Бактериородопсин. Анну Рев Физиол 66: 665-688. DOI: https: //doi.org/10.1146/annurev.physiol.66.032102.150049. PubMed: 14977418.
  22. 22. Lanyi JK (1992) Перенос протонов и взаимодействие энергии в фотоцикле бактериородопсина.J Bioenerget Biomembr 24: 169-179. DOI: https: //doi.org/10.1007/BF00762675. PubMed: 1326515.
  23. 23. Chow BY, Han X, Dobry AS, Qian X, Chuong AS и др. (2010) Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное молчание с помощью световых протонных насосов. Природа 463: 98–102. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature08652. PubMed: 20054397.
  24. 24. Kralj JM, Hochbaum DR, Douglass AD, Cohen AE (2011) Электрический всплеск в Escherichia coli, зондированный флуоресцентным белком, указывающим напряжение.Наука 333: 345–348. DOI: https: //doi.org/10.1126/science.1204763. PubMed: 21764748.
  25. 25. Kralj JM, Douglass AD, Hochbaum DR, Maclaurin D, Cohen AE (2012) Оптическая запись потенциалов действия в нейронах млекопитающих с использованием микробного родопсина. Нат Методы 9: 90–95. DOI: https: //doi.org/10.1038/nchembio.1135.
  26. 26. Wilt BA, Fitzgerald JE, Schnitzer MJ (2013) Пределы дробового шума фотона при оптическом обнаружении нейрональных спайков и оценке времени спайков.Biophys J 104: 51-62. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.058. PubMed: 23332058.
  27. 27. Gradinaru V, Thompson KR, Deisseroth K (2008) eNpHR: halorhodopsin Natronomonas, усиленный для оптогенетических применений. Brain Cell Biol. 36: 129–139. DOI: https: //doi.org/10.1007/s11068-008-9027-6. PubMed: 18677566.
  28. 28. Градинару В., Чжан Ф., Рамакришнан С., Мэттис Дж., Пракаш Р. и др. (2010) Молекулярные и клеточные подходы к диверсификации и расширению оптогенетики.Cell 141: 154–165. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.cell.2010.02.037. PubMed: 20303157.
  29. 29. Hofherr A, Fakler B, Klöcker N (2005) Селективный экспорт Kir2.1 по Гольджи контролирует стехиометрию функциональных гетеромеров канала Kir2.x. J Cell Sci 118: 1935-1943. DOI: https: //doi.org/10.1242/jcs.02322. PubMed: 15827083.
  30. 30. Мэттис Дж., Тай К.М., Ференци Э.А., Рамакришнан С., О’Ши Д.Д. и др. (2011) Принципы применения оптогенетических инструментов, полученные на основе прямого сравнительного анализа микробных опсинов.Нат Методы 9: 159-172. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1808. PubMed: 22179551.
  31. 31. Колоднер П., Лукашев Е.П., Чинг Ю.С., Руссо Д.Л. (1996) Депротонирование основания Шиффа, индуцированное электрическим полем, в мутантном бактериородопсине D85N. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 11618–11621. DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.93.21.11618. PubMed: 8876185.
  32. 32. Мольтке С., Кребс М.П., ​​Моллаагабаба Р., Хорана Х.Г., Хейн М.П. (1995) Внутримолекулярный перенос заряда в мутантах бактериородопсина Asp85-Asn и Asp212-Asn: влияние pH и анионов.Biophys J 69: 2074-2083. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0006-3495 (95) 80078-0. PubMed: 8580351.
  33. 33. Marinetti T, Subramaniam S, Mogi T., Marti T, Khorana HG (1989) Замена аспарагиновых остатков 85, 96, 115 или 212 влияет на квантовый выход и кинетику высвобождения и захвата протонов бактериородопсином. Proc. Надль. Акад. Sci. США 86: 529-53.
  34. 34. Kalaidzidis IV, Kaulen AD (1997) Cl-зависимые реакции бактериородопсина на фотоэдс: сравнение мутантов D85T и D85S и кислой пурпурной формы дикого типа.FEBS Lett 418: 239-242. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0014-5793 (97) 01390-2. PubMed: 9428720.
  35. 35. Саиди П., Мусаабади Дж. М., Себтахмади С. С., Бехманеш М., Мехрабади Дж. Ф. (2012) Сайт-направленный мутагенез мутантов бактериородопсина и их характеристика для биоэлектрического и биотехнологического оборудования. Biotechnol Lett 34: 455–462. DOI: https: //doi.org/10.1007/s10529-011-0731-4. PubMed: 22270563.
  36. 36. Ryan MD, Drew J (1994) Опосредованное олигопептидом 2A вируса ящура 2A расщепление искусственного полипротеина.EMBO J 13: 928–933. PubMed: 8112307.
  37. 37. Шимчак А.Л., Воркман С.Дж., Ван Й., Виньяли К.М., Дилиоглу С. и др. (2004) Коррекция мультигенного дефицита in vivo с использованием одного ретровирусного вектора на основе «саморасщепляющегося» пептида 2А. Nat Biotechnol 22: 589-594. DOI: https: //doi.org/10.1038/nbt957. PubMed: 15064769.
  38. 38. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K (2005) Миллисекундная шкала времени, генетически направленный оптический контроль нейронной активности.Nat Neurosci 8: 1263–1268. DOI: https: //doi.org/10.1038/nn1525. PubMed: 16116447.
  39. 39. Акербум Дж., Чен Т.В., Уордилл Т.Дж., Тиан Л., Марвин Дж. С. и др. (2012) Оптимизация индикатора кальция GCaMP для визуализации нервной активности. J. Neurosci 32: 13819-13840. DOI: https: //doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2601-12.2012. PubMed: 23035093.
  40. 40. Akemann W, Mutoh H, Perron A, Rossier J, Knöpfel T (2010) Визуализация электрических сигналов мозга с помощью генетически нацеленных чувствительных к напряжению флуоресцентных белков.Nat. Методы 7: 643–649. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1479. PubMed: 20622860.
  41. 41. Shamah SM, Lin MZ, Goldberg JL, Estrach S, Sahin M et al. (2001) Рецепторы EphA регулируют динамику конуса роста с помощью нового фактора обмена гуаниновых нуклеотидов - эфексина. Ячейка 105: 233-244. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0092-8674 (01) 00314-2. PubMed: 11336673.

Martindale VIPD138 Комплект индикатора напряжения и испытательного устройства

Martindale VIPD138 Индикатор напряжения VI-13800 и испытательное устройство PD440

vipd138

Комплект индикатора напряжения

Martindale VIPD138 Индикатор напряжения VI-13800 (без предохранителя) и комплекты испытательного устройства PD440 являются частью ассортимента продукции для электрического испытательного оборудования Martindale .

Комплект Martindale VIPD138 включает индикатор напряжения VI-13800 и соответствующий блок проверки PD440. Комплекты поставляются в комбинированных переносных чемоданах TC69, чтобы гарантировать, что контрольные устройства всегда будут под рукой, и обеспечить безопасную изоляцию на месте в соответствии с Правилами об электричестве на работе.

Martindale VI-13800 Индикатор напряжения обеспечивает мгновенную визуальную индикацию переменного и постоянного напряжения в четыре этапа от 50 до 400 В.

Яркие светодиодные индикаторы с длительным сроком службы дают четкое и мгновенное отображение диапазона уровня напряжения.Индикатор имеет выдвижные щупы, усиленные защитные кожухи для пальцев и двухслойный кабель с двойной изоляцией с белым внутренним сердечником, который четко указывает на повреждения, которые могут поставить под угрозу безопасность пользователя.

Martindale PD440 - это испытательное устройство 440 В переменного тока, предназначенное для полной проверки индикаторов напряжения в соответствии с рекомендациями по охране здоровья и безопасности.

Использование индикатора напряжения без предварительной проверки правильности его работы может оказаться фатальным. PD440 совместим с новыми Martindale VI-13800 и Martindale VI-13700.

Его также можно использовать для проверки Драммонда и других ламп накаливания , а также стандартных мультиметров и двухполюсных индикаторов напряжения других производителей.

Электрическое испытательное оборудование, обнаружение напряжения и безопасная изоляция | Посмотреть модельный ряд Martindale Electric .

Мартиндейл viPD138

Технические характеристики

Martindale VI-13800 Индикатор напряжения Устройство для испытаний Martindale PD440
Диапазон напряжения 50-400 В переменного / постоянного тока Выходное напряжение выход = 400 В номинал
50 Гц номинал
Светодиодная индикация +/- 50,100,200,400 В
Индикация полярности и напряжения от 12В Диапазон рабочих температур от -10 до 40 ° C при макс.70% относительной влажности
Обнаружение напряжения переменного / постоянного тока Автомат Размеры 143 x 84 x 50 мм
Обнаружение диапазона Автомат Масса 400 г примерно с батареями
Время ответа <0,1 с Батареи 6 x LR6 (MN1500) 1,5 В щелочные батареи или эквивалент
(в комплекте)
Диапазон частот DC, 0-65 Гц
Испытательный ток 3.5 мА макс. При 400 В перем. / Пост. Тока
Коэффициент нагрузки 30 с ВКЛ / 240 с ВЫКЛ
Диапазон температур от -10 ° C до + 55 ° C
Влажность макс. 85% отн.
Высота до 2000 м
Категория перенапряжения CATIV / 600V CATIII 1000V
Степень загрязнения 2
Охрана окружающей среды IP54
Безопасность BS EN 61243-3: 2010 GS38
Вес ок.130 г
Размеры ок. 205 x 67 x 27 мм

Электрическое испытательное оборудование, обнаружение напряжения и безопасная изоляция | Посмотреть модельный ряд Martindale Electric .

комплекты мартиндейл

сравнение

VIPD138 ВИПЛОК138 VIPDLOKPRO138
VI-13800 Индикатор напряжения * * *
Блок расстойки PD440 * * *
Комбинированный кейс TC69 * * *
LOKKIT1 Комплект из 12 предметов *
LOKKITPRO 17-компонентный комплект *
Электробезопасность LV MV HV

Thorne & Derrick International распространяет широкий спектр оборудования для электрических испытаний, обнаружения напряжения и безопасной изоляции для использования в подземных кабельных системах и проводных сетях воздушных линий для сетей низкого напряжения LV, низкого напряжения, MV среднего и HV высокого напряжения - включая сети среднего / высокого напряжения 600/1000 В, 11 кВ, 33 кВ, 66 кВ, 132 кВ и сети передачи и распределения 275/400 кВ.

Martindale VI-13800 Индикатор напряжения - Martindale Electric

Описание

VI13800 является важным инструментом для проверки обесточивания электрических цепей перед проведением работ по техническому обслуживанию и установке в соответствии с процедурами безопасной изоляции. VI13800 обеспечивает безопасность за счет простоты, без диапазонов, переключателей или батареек, что снижает риск неправильных показаний.

VI13800 обеспечивает мгновенную визуальную индикацию переменного и постоянного напряжения в четыре этапа от 50 В до 400 В.Яркие светодиодные индикаторы с длительным сроком службы дают четкое и мгновенное отображение диапазона уровня напряжения. Он имеет выдвижные зонды, усиленные защитные кожухи для пальцев и двухслойный кабель с двойной изоляцией с белым внутренним сердечником, который четко указывает на повреждения, которые могут поставить под угрозу безопасность пользователя.

Последняя конструкция соответствует новому стандарту, касающемуся 2-полюсного индикатора напряжения, BS EN61243-3 и требованиям GS38 Edition 4 2015. Последняя версия BS EN61243-3: 2010 полностью вступила в силу в мае 2013 года, и все напряжения индикаторы британского и европейского рынка должны соответствовать.VI13800 заменяет промышленный стандарт VI13700.

Основанная на VI13700, новая конструкция включает в себя резистор высокой мощности вместо предохранителя, который ограничивает ток в случае повреждения кабеля в соответствии с BS EN61243-3. Защита встроена там, где это необходимо, в ручном зонде, а не только в приборе, обеспечивая превосходную защиту пользователя по сравнению с другими тестерами. Наконечники зондов имеют выдвижные крышки, которые можно зафиксировать на месте и не потерять.
Мартиндейл VI13700 широко используется в течение многих лет, и в его конструкцию всегда включен предохранитель для ограничения тока в случае повреждения кабеля. За исключением усиленного предохранителя / резистора в пробнике, все остальное в технических характеристиках VI13800 идентично VI13700 / 2, включая контрастную внутреннюю оболочку кабеля для быстрой идентификации повреждения кабеля. Чтобы отличить VI13700 / 2 от VI13800, новая модель зонд полностью заменен на черный вместо желтого.Пробник имеет четкую маркировку «защита по сопротивлению», а не номинал предохранителя. Он герметичен и не содержит деталей, заменяемых пользователем.

Нет особых требований к замене используемых продуктов VI13700. NB Для любого индикатора напряжения всегда следует использовать надлежащие процедуры проверки.

Новый VI13800 можно приобрести отдельно или в составе комплекта VIPD138LOK, содержащего все необходимое для работы на месте. В комплект входят испытательный блок Мартиндейла, комбинированный кейс для переноски и запорные устройства, обеспечивающие полное соответствие рекомендациям по охране труда и технике безопасности для безопасной работы, которые требуют проверки индикаторов напряжения до и после использования и блокировки точки изоляции с предупреждением. .

Aerostich Мотоциклетные куртки, костюмы, одежда и снаряжение


Международные заказы
Курсы обмена валют являются приблизительными. Все продажи производятся в долларах (USD), а конвертация производится процессинговыми банками на фактическую дату транзакции.
Только США
Срок поставки
ECO Saver не гарантируется. Недоступно для заказов на сумму более 100 долларов США.
США
Возможности доставки
ПОВЕРХНОСТЬ и ВОЗДУХ гарантируются.
Заказы Eco Saver Поверхность Приоритет / 3 дня 2 дня * 1 день * Интернэшнл Эйр ***
до 50 долларов США $ 4–8 $ 8–13 $ 14–19 $ 20–26 30–36 долл. США 20,95–60,95 долл. США
51–100 долл. США 7–12 долларов 11–17 долларов 17–23 доллара 24–30 долларов 36–42 долл. США 25 долларов.95-80,95 долл. США
101–200 долл. США Нет в наличии $ 14–19 21–27 долларов 28–36 долларов 42–50 долларов 30,95–100,95 долл. США
201–400 долл. Нет в наличии 16–21 доллар 25–31 долл. США 36–42 долл. США 50–58 долларов США 40,95–120,95 долл. США
Более 400 долларов США Нет в наличии 18–23 доллара 29–35 долларов США 42–48 долларов 56–66 долларов 60 долларов.95–150,95 долл. США
  • Наземный транспорт только по адресам в США.
  • * ДОСТАВКА В СУББОТУ: Добавьте 15 долларов США к 1-дневному или 2-дневному обслуживанию.
  • ** Добавьте 15 долларов США к 1 или 2 дням для Аляски, Гавайев и Пуэрто-Рико. (В сельской местности может взиматься дополнительная плата в размере 12 долларов США.)
  • *** Звоните, чтобы узнать международные тарифы. В зависимости от страны, большинство сборов будет между этими ставками. Пошлины и налоги не включены в стоимость доставки.FedEx может взимать брокерские сборы в некоторых странах. Вы несете ответственность за эти расходы.
  • Адреса AFO / APO: Заказы будут отправлены приоритетной почтой.

Все имеющиеся в наличии продукты Aerostich и товары из каталога RiderWearHouse, заказанные до 14:00 CST, будут отправлены в течение 2 рабочих дней. (Если костюм Roadcrafter определенного размера и цвета отсутствует на складе, мы сообщим вам предполагаемую дату доставки. Время изготовления варьируется.) Все стандартные предметы Aerostich могут быть отправлены обратно для возврата, но возвращаемые предметы должно быть в новом состоянии.

Заказы по всему миру

Покупать напрямую из США легко и удобно. Кредитные карты, факсимильные аппараты, телефонная связь с прямым набором номера и воздушная доставка позволяют легко совершать транзакции между странами. Для оценки стоимости пошлин и НДС посетите https://www.simplyduty.com/import-calculator/, сторонний калькулятор импортных пошлин.

Мы не взимаем и не покрываем пошлины, налоги или брокерские сборы. FedEx может взимать брокерские сборы в некоторых странах. Вы несете ответственность за эти расходы.

Лучший цифровой индикатор напряжения - отличные предложения на цифровой индикатор напряжения от мировых продавцов цифровых индикаторов напряжения

Отличные новости !!! Вы находитесь в нужном месте для цифрового индикатора напряжения. К настоящему времени вы уже знаете, что что бы вы ни искали, вы обязательно найдете это на AliExpress. У нас буквально есть тысячи отличных продуктов во всех товарных категориях. Ищете ли вы товары высокого класса или дешевые и недорогие оптовые закупки, мы гарантируем, что он есть на AliExpress.

Вы найдете официальные магазины торговых марок наряду с небольшими независимыми продавцами со скидками, каждый из которых предлагает быструю доставку и надежные, а также удобные и безопасные способы оплаты, независимо от того, сколько вы решите потратить.

AliExpress никогда не уступит по выбору, качеству и цене.Каждый день вы найдете новые онлайн-предложения, скидки в магазинах и возможность сэкономить еще больше, собирая купоны. Но вам, возможно, придется действовать быстро, поскольку этот лучший цифровой индикатор напряжения вскоре станет одним из самых востребованных бестселлеров. Подумайте, как вам будут завидовать друзья, когда вы скажете им, что приобрели цифровой индикатор напряжения на AliExpress. Благодаря самым низким ценам в Интернете, дешевым тарифам на доставку и возможности получения на месте вы можете еще больше сэкономить.

Если вы все еще не уверены в цифровом индикаторе напряжения и думаете о выборе аналогичного товара, AliExpress - отличное место для сравнения цен и продавцов.Мы поможем вам решить, стоит ли доплачивать за высококлассную версию или вы получаете столь же выгодную сделку, приобретая более дешевую вещь. И, если вы просто хотите побаловать себя и потратиться на самую дорогую версию, AliExpress всегда позаботится о том, чтобы вы могли получить лучшую цену за свои деньги, даже сообщая вам, когда вам будет лучше дождаться начала рекламной акции. и ожидаемая экономия.AliExpress гордится тем, что у вас всегда есть осознанный выбор при покупке в одном из сотен магазинов и продавцов на нашей платформе.Реальные покупатели оценивают качество обслуживания, цену и качество каждого магазина и продавца. Кроме того, вы можете узнать рейтинги магазина или отдельных продавцов, а также сравнить цены, доставку и скидки на один и тот же продукт, прочитав комментарии и отзывы, оставленные пользователями. Каждая покупка имеет звездный рейтинг и часто имеет комментарии, оставленные предыдущими клиентами, описывающими свой опыт транзакций, поэтому вы можете покупать с уверенностью каждый раз. Короче говоря, вам не нужно верить нам на слово - просто слушайте миллионы наших довольных клиентов.

И, если вы новичок на AliExpress, мы откроем вам секрет. Непосредственно перед тем, как вы нажмете «купить сейчас» в процессе транзакции, найдите время, чтобы проверить купоны - и вы сэкономите еще больше. Вы можете найти купоны магазина, купоны AliExpress или собирать купоны каждый день, играя в игры в приложении AliExpress. Вместе с бесплатной доставкой, которую предлагают большинство продавцов на нашем сайте, вы сможете приобрести digital Voltage indicator по самой выгодной цене.

Автор: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *